【实验目的】 1.掌握酶竞争性抑制作用的特点。 2.验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 【实验原理】 某些物质的化学结构与酶作用的底物结构相似，可与底物竞争结合酶的活性中心。当其占据 了酶的活性中心以后，底物就不能与酶的活性中心结合，从而阻碍酶-底物复合物的形成，使酶的 活性降低甚至丧失。这种抑制作用称为竞争性抑制作用(competitive inhibition)。很多临床用药是 酶的竞争性抑制剂，如磺胺类药物、6巯基嘌呤、5氟尿嘧啶等。竞争性抑制剂作用的特点是使酶 的Km增大、Vmax不变，抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对 比例（四/S])。如果[S不变，则抑制作用随着四的增加而增强：反之，如果四不变，则抑制作用 随着S]的增加而减弱。当[S]足够大时，可消除抑制作用。 琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要脱氢酶，其辅基为FAD。心肌、骨骼肌、 肝等组织中都含有较丰富的琥珀酸脱氢酶。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢，转变成延胡索酸，FAD 接受脱下的2H生成FADH2。在生物体内，通过一系列递氢体和递电子体的传递，脱下的氢最终 与氧结合而生成水，同时释放出能量，供机体利用。在体外实验中，利用常用的氧化还原反应指 示剂一甲烯蓝作为受氢体，反应生成的FADH,可以将蓝色的甲烯蓝（氧化型）还原为无色的甲烯 白（还原型）。 丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。因为丙二酸(HOOC-CH2一COOH)的化学结构与 琥珀酸相以，可以竞争性地与琥珀酸脱氢酶活性中心结合，从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。 本实验以甲烯蓝为受氢体，在无氧条件下（因为生成的甲烯白容易再被空气中的氧重新氧化 为甲烯蓝)，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变，并观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 抑制作用。酶活性高，则甲烯蓝褪色时间较短：酶活性降低，则甲烯蓝褪色时间延长。 HOOC-CH2-CH2-COOH FAD H甲烯白（无色） 琥珀酸脱氢酶 HOOC-CH-CH-COOH FADH2 G甲烯蓝（蓝色） 图1-9琥珀酸脱氢酶活性检测原理 【实验材料与仪器】 1.器材： 大白鼠、手术剪、镊子、瓷盘、匀浆器或玻璃研钵、天平、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管 及试管架、吸量管、恒温水浴箱、电热水浴锅。 2.试剂： (1)0.2mol/L琥珀酸溶液 (2)0.02mol/L琥珀酸溶液 (3)0.2mol/L丙二酸溶液 (4)0.02mol/L丙二酸溶液 以上4种溶液均先用5mol/L NaOH溶液调节pH值为7.0，再用0.01mol/L NaOH溶液调节pH 值为7.4，然后加蒸馏水定容。 (5)1/15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4):量取1/15mo/L磷酸氢二钠溶液80.8ml、1/15mol/L 磷酸二氢钾溶液19.2ml混匀，此混合液pH值应为7.4。 1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠9.47g,溶解于蒸馏水中并稀释至1000ml。 14
14 【实验目的】 1．掌握酶竞争性抑制作用的特点。 2．验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 【实验原理】 某些物质的化学结构与酶作用的底物结构相似，可与底物竞争结合酶的活性中心。当其占据 了酶的活性中心以后，底物就不能与酶的活性中心结合，从而阻碍酶-底物复合物的形成，使酶的 活性降低甚至丧失。这种抑制作用称为竞争性抑制作用（competitive inhibition）。很多临床用药是 酶的竞争性抑制剂，如磺胺类药物、6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶等。竞争性抑制剂作用的特点是使酶 的 Km 增大、Vmax 不变，抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对 比例（[I]/[S]）。如果[S]不变，则抑制作用随着[I]的增加而增强；反之，如果[I]不变，则抑制作用 随着[S]的增加而减弱。当[S]足够大时，可消除抑制作用。 琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要脱氢酶，其辅基为 FAD。心肌、骨骼肌、 肝等组织中都含有较丰富的琥珀酸脱氢酶。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢，转变成延胡索酸，FAD 接受脱下的 2H 生成 FADH2。在生物体内，通过一系列递氢体和递电子体的传递，脱下的氢最终 与氧结合而生成水，同时释放出能量，供机体利用。在体外实验中，利用常用的氧化还原反应指 示剂—甲烯蓝作为受氢体，反应生成的 FADH2 可以将蓝色的甲烯蓝（氧化型）还原为无色的甲烯 白（还原型）。 丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。因为丙二酸（HOOC—CH2—COOH）的化学结构与 琥珀酸相似，可以竞争性地与琥珀酸脱氢酶活性中心结合，从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。 本实验以甲烯蓝为受氢体，在无氧条件下（因为生成的甲烯白容易再被空气中的氧重新氧化 为甲烯蓝），以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变，并观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 抑制作用。酶活性高，则甲烯蓝褪色时间较短；酶活性降低，则甲烯蓝褪色时间延长。 【实验材料与仪器】 1．器材： 大白鼠、手术剪、镊子、瓷盘、匀浆器或玻璃研钵、天平、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管 及试管架、吸量管、恒温水浴箱、电热水浴锅。 2．试剂： （1）0.2 mol/L 琥珀酸溶液 （2）0.02 mol/L 琥珀酸溶液 （3）0.2 mol/L 丙二酸溶液 （4）0.02 mol/L 丙二酸溶液 以上 4 种溶液均先用 5 mol/L NaOH 溶液调节 pH 值为 7.0，再用 0.01 mol/L NaOH 溶液调节 pH 值为 7.4，然后加蒸馏水定容。 （5）1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）：量取 1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液 80.8 ml、1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液 19.2 ml 混匀，此混合液 pH 值应为 7.4。 1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠 9.47 g，溶解于蒸馏水中并稀释至 1000 ml。 图 1-9 琥珀酸脱氢酶活性检测原理
1/15ol/L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾9.08g,溶解于蒸馏水中并稀释至1000ml。 (6)0.02%甲烯蓝 (7)液体石蜡 【实验步骤】 1.酶提取液的制备 重物猛击大白鼠头部致昏迷，颈剪放血，分离出肌肉。称取4g肌肉，剪成碎块，用冰冷的蒸 馏水洗三次。按1g肌肉加5ml磷酸缓冲液的比例，加入冰冷的1/15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)。 在匀浆器中进行匀浆。然后用双层纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤液备用。过滤时可以稍加挤 压以利于过滤液流出。 2.取试管6支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-8酶的竞争性抑制作用 试管编号 试剂 3 x 5 6 酶提取液ml 2 2 2 2# 1/15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)/ml 2 0.2mo/L琥珀酸溶液/滴 8 8 8 8 F 0.02mol/L琥珀酸溶液/滴 8 0.2mol/L丙二酸溶液/滴 8 8 0.02mol/L丙二酸溶液/滴 蒸馏水/滴 8 8 8 甲烯蓝/滴 3 3 3 各管溶液立即混匀，沿管壁加入液体石蜡5~10滴，使其在反应液面上形成一薄层（约0.5 cm厚的油层)以达到隔绝空气的作用。 各管置于37℃水浴中保温，切勿摇动试管。 随时观察比较各管颜色的变化情况，记录褪色所需时间。 各管四/[S] 完全褪色所需时间 #6号试管中，酶提取液先在100℃水浴加热煮沸5min。 3.根据实验结果分析： (1)酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？ (2)各管的褪色情况有何区别？为什么？ (3)丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型及其特点是什么？ (4)本实验中5号、6号试管的作用是什么？ 【注意事项】 1.酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2.加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以免空气中的氧进入试管而影响实验结果。因此加液体 石蜡时，应将试管倾斜，沿着试管管壁加入，注意不要产生气泡。 3.37℃水浴保温过程中不能摇动试管，是为了避免空气中的氧与反应溶液接触而使还原型甲 烯蓝重新氧化变蓝。 4.37℃水浴中保温过程中，应注意随时观察各管褪色情况。 5.实验结束后，一定要清洗干净试管内的液体石蜡。 【思考题】 1.在酶提取液的制备过程中，为什么肌肉要用冰冷的蒸馏水洗三次？ 2.实验中加入液体石蜡的作用是什么？ 15
15 1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾 9.08 g，溶解于蒸馏水中并稀释至 1000 ml。 （6）0.02% 甲烯蓝 （7）液体石蜡 【实验步骤】 1．酶提取液的制备 重物猛击大白鼠头部致昏迷，颈剪放血，分离出肌肉。称取 4 g 肌肉，剪成碎块，用冰冷的蒸 馏水洗三次。按 1 g 肌肉加 5 ml 磷酸缓冲液的比例，加入冰冷的 1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）。 在匀浆器中进行匀浆。然后用双层纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤液备用。过滤时可以稍加挤 压以利于过滤液流出。 2．取试管 6 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-8 酶的竞争性抑制作用 试剂 试管编号 1 2 3 4 5 6 酶提取液 /ml 2 2 2 2 — 2# 1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）/ml — — — — 2 — 0.2 mol/L 琥珀酸溶液 /滴 8 8 8 — 8 8 0.02 mol/L 琥珀酸溶液 /滴 — — — 8 — — 0.2 mol/L 丙二酸溶液 /滴 — — 8 8 — 0.02 mol/L 丙二酸溶液 /滴 — 8 — — — — 蒸馏水 /滴 8 — — — 8 8 甲烯蓝 /滴 3 3 3 3 3 3 各管溶液立即混匀，沿管壁加入液体石蜡 5～10 滴，使其在反应液面上形成一薄层（约 0.5 cm 厚的油层）以达到隔绝空气的作用。 各管置于 37℃水浴中保温，切勿摇动试管。 随时观察比较各管颜色的变化情况，记录褪色所需时间。 各管[I]/[S] 完全褪色所需时间 # 6 号试管中，酶提取液先在 100℃水浴加热煮沸 5 min。 3．根据实验结果分析： （1）酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？ （2）各管的褪色情况有何区别？为什么？ （3）丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型及其特点是什么？ （4）本实验中 5 号、6 号试管的作用是什么？ 【注意事项】 1．酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2．加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以免空气中的氧进入试管而影响实验结果。因此加液体 石蜡时，应将试管倾斜，沿着试管管壁加入，注意不要产生气泡。 3．37℃水浴保温过程中不能摇动试管，是为了避免空气中的氧与反应溶液接触而使还原型甲 烯蓝重新氧化变蓝。 4．37℃水浴中保温过程中，应注意随时观察各管褪色情况。 5．实验结束后，一定要清洗干净试管内的液体石蜡。 【思考题】 1．在酶提取液的制备过程中，为什么肌肉要用冰冷的蒸馏水洗三次？ 2．实验中加入液体石蜡的作用是什么？