液(pH7.4)中，用1mol/LNa0H溶液调节pH值为7.4，再用0.1molL磷酸缓冲液(pH7.4)定 容至100ml。可加数滴氯仿以防腐，置于4℃冰箱可保存数周。 (4)1mmo1/L2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼19.8mg,溶于7ml浓盐酸中， 待溶解后以蒸馏水定容至100ml。置于棕色瓶中暗处保存。如有结晶析出应重新配制。 (5)0.4mol/LNa0H溶液：称取Na0H16.0g,溶解于蒸馏水中，以蒸馏水定容至1000ml。 室温下可长期保存。 【实验步骤】 1.标准曲线的制作 (1)取试管6支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-2丙酮酸标准曲线的制作 试管编号 试剂 2 3 4 J 6 2mmol/L丙酮酸标准液ml 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 丙氨酸氨基转移酶底物液ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)ml 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 各管混匀后，置于37℃水浴中预温5min。 2,4-二硝基苯肼溶液ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 各管混匀后，置于37℃水浴中保温20min。 0.4mol/L NaOH溶液/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 充分混匀。10min后，30min内在520nm处比色。 以蒸馏水调零，读取各管吸光度值。 丙酮酸的实际含量(mol) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 各管吸光度值A520 各管吸光度值减去空白管（第一管）吸 光度值的差值 (2)以各管吸光度值减去空白管（第一管）吸光度值的差值为纵坐标，以丙酮酸的实际含量 (umol)为横坐标，绘制标准曲线。 2.血清ALT酶活性的测定 取试管3支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-3血清丙氨酸氨基转移酶活性的测定 试管编号 试剂 测定管1 测定管2 对照管 丙氨酸氨基转移酶底物液ml 0.5 0.5 0.5 各管混匀后，置于37℃水浴中预温5min。 血清ml 0.1 0.1 各管混匀后，置于37℃水浴中准确保温30min。 2,4-二硝基苯肼溶液/ml 0.5 0.5 0.5 血清/ml 0.1 各管混匀后，置于37℃水浴中保温20min。 0.4mol/L NaOH溶液/ml 5.0 5.0 5.0 充分混匀。10min后，30min内在520nm处比色。 以蒸馏水调零，读取各管吸光度值。 各管吸光度值A520 测定管吸光度值减去对照管吸光度值的差值 9
9 液（pH7.4）中，用 1 mol/L NaOH 溶液调节 pH 值为 7.4，再用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）定 容至 100 ml。可加数滴氯仿以防腐，置于 4℃冰箱可保存数周。 （4）1 mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液：称取 2，4-二硝基苯肼 19.8 mg，溶于 7 ml 浓盐酸中， 待溶解后以蒸馏水定容至 100 ml。置于棕色瓶中暗处保存。如有结晶析出应重新配制。 （5）0.4 mol/L NaOH 溶液：称取 NaOH 16.0 g，溶解于蒸馏水中，以蒸馏水定容至 1000 ml。 室温下可长期保存。 【实验步骤】 1. 标准曲线的制作 （1）取试管 6 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-2 丙酮酸标准曲线的制作 试剂 试管编号 1 2 3 4 5 6 2 mmol/L 丙酮酸标准液 /ml — 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 丙氨酸氨基转移酶底物液 /ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）/ml 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 各管混匀后，置于 37℃水浴中预温 5 min。 2，4-二硝基苯肼溶液 /ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 各管混匀后，置于 37 ℃水浴中保温 20 min。 0.4 mol/L NaOH 溶液 /ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 充分混匀。10 min 后，30 min 内在 520 nm 处比色。 以蒸馏水调零，读取各管吸光度值。 丙酮酸的实际含量（μmol） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 各管吸光度值 A520 各管吸光度值减去空白管（第一管）吸 光度值的差值 （2）以各管吸光度值减去空白管（第一管）吸光度值的差值为纵坐标，以丙酮酸的实际含量 （μmol）为横坐标，绘制标准曲线。 2．血清 ALT 酶活性的测定 取试管 3 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-3 血清丙氨酸氨基转移酶活性的测定 试剂 试管编号 测定管 1 测定管 2 对照管 丙氨酸氨基转移酶底物液 /ml 0.5 0.5 0.5 各管混匀后，置于 37℃水浴中预温 5 min。 血清 /ml 0.1 0.1 — 各管混匀后，置于 37℃水浴中准确保温 30 min。 2，4-二硝基苯肼溶液 /ml 0.5 0.5 0.5 血清 /ml — — 0.1 各管混匀后，置于 37℃水浴中保温 20 min。 0.4 mol/L NaOH 溶液 /ml 5.0 5.0 5.0 充分混匀。10 min 后，30 min 内在 520 nm 处比色。 以蒸馏水调零，读取各管吸光度值。 各管吸光度值 A520 测定管吸光度值减去对照管吸光度值的差值
用测定管吸光度值减去对照管吸光度值的差值平均数，从标准曲线查出相应的丙酮酸的含量 (umol),并换算出丙酮酸的μg数。 3.血清ALT活性计算 本方法规定血清在37℃、pH为7.4时与ALT底物液作用30min,每生成2.5g丙酮酸所需 的酶量为1个酶活性单位(U)。根据实验结果计算每ml血清中ALT活性。 ALT活性(U血清)。换算出的丙酮酸以g数X⊥ 2.5 0.1 【注意事项】 1.转氨酶催化的反应是可逆反应，反应体系中除了有丙酮酸外，还有-酮戊二酸。2,4二 硝基苯肼可以与含有-C=0基团的化合物作用，生成相应的苯腙。因此-酮戊二酸也能与2,4二 硝基苯肼作用，生成-酮戊二酸2,4二硝基苯踪，产物在碱性条件下也显棕红色从而干扰丙酮酸 的测定。本实验中采取了以下几个措施以减少-酮戊二酸对实验的干扰，提高测定的准确性： (1)配制底物液时，丙氨酸和-酮戊二酸浓度比为100：1，促进反应向生成丙酮酸的方向 进行。 (2)制作标准曲线时，加入适量底物液（内含α-酮戊二酸），尽量使标准曲线的测定与实际 测定情况一致以抵消-酮戊二酸的影响。 (3)比色测定时，选择合适的波长。两种苯腙的吸收光谱曲线有差别。丙酮酸2,4二硝基 苯腙在450m处有最大吸收峰，a-酮戊二酸2,4-二硝基苯腙在380m处有最大吸收峰，二者在 520nm处吸光度的差异最大。因此本实验采用520nm作比色测定。 2.酶活性较高时，底物中-酮戊二酸浓度很低，不能保证酶促反应的充分进行，测定结果与 酶活性不成正比，准确性降低。酶活性较低时，生成丙酮酸较少，测定值与对照值相差很小，测 定结果的准确性也降低。因此本方法只是在一个较小范围内生成丙酮酸的量与酶活性成正比。在 标准曲线的直线范围内进行测定准确性高。 3.如果血清中ALT酶活性过高，可以适当稀释后再进行测定。 4.血细胞中也含有ALT,如果取血时发生溶血会导致血清ALT活性增高。故溶血标本不宜 使用。 5.在进行酶活性测定时，为防止溶血或其他因素对酶活性的影响，所用的所有器皿应清洗干 净、干燥后使用，试剂配制、用量、pH值、反应时间和温度等均要严格控制。 6.一般正常人每毫升血清中ALT活性小于40U。 【思考题】 1.制作的标准曲线可测范围是多少？如果样品管的吸光度值超出可测范围的上限，应该怎样 处理？ 2.底物液配制时为什么不能使用D-氨基酸？ 3.可以采取哪些措施减少-酮戊二酸对丙酮酸测定的干扰？ (李梨) 实验五、胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素 【实验目的】 1.掌握影响酶作用的因素。 2.熟悉胰酶对蛋白质的消化作用。 【实验原理】 10
10 用测定管吸光度值减去对照管吸光度值的差值平均数，从标准曲线查出相应的丙酮酸的含量 （μmol），并换算出丙酮酸的 μg 数。 3．血清 ALT 活性计算 本方法规定血清在 37℃、pH 为 7.4 时与 ALT 底物液作用 30 min，每生成 2.5 μg 丙酮酸所需 的酶量为 1 个酶活性单位（U）。根据实验结果计算每 ml 血清中 ALT 活性。 【注意事项】 1．转氨酶催化的反应是可逆反应，反应体系中除了有丙酮酸外，还有 α-酮戊二酸。2，4-二 硝基苯肼可以与含有-C=O 基团的化合物作用，生成相应的苯腙。因此 α-酮戊二酸也能与 2，4-二 硝基苯肼作用，生成 α-酮戊二酸 2，4-二硝基苯腙，产物在碱性条件下也显棕红色从而干扰丙酮酸 的测定。本实验中采取了以下几个措施以减少 α-酮戊二酸对实验的干扰，提高测定的准确性： （1）配制底物液时，丙氨酸和 α-酮戊二酸浓度比为 100：1，促进反应向生成丙酮酸的方向 进行。 （2）制作标准曲线时，加入适量底物液（内含 α-酮戊二酸），尽量使标准曲线的测定与实际 测定情况一致以抵消 α-酮戊二酸的影响。 （3）比色测定时，选择合适的波长。两种苯腙的吸收光谱曲线有差别。丙酮酸 2，4-二硝基 苯腙在 450 nm 处有最大吸收峰，α-酮戊二酸 2，4-二硝基苯腙在 380 nm 处有最大吸收峰，二者在 520 nm 处吸光度的差异最大。因此本实验采用 520 nm 作比色测定。 2．酶活性较高时，底物中 α-酮戊二酸浓度很低，不能保证酶促反应的充分进行，测定结果与 酶活性不成正比，准确性降低。酶活性较低时，生成丙酮酸较少，测定值与对照值相差很小，测 定结果的准确性也降低。因此本方法只是在一个较小范围内生成丙酮酸的量与酶活性成正比。在 标准曲线的直线范围内进行测定准确性高。 3．如果血清中 ALT 酶活性过高，可以适当稀释后再进行测定。 4．血细胞中也含有 ALT，如果取血时发生溶血会导致血清 ALT 活性增高。故溶血标本不宜 使用。 5．在进行酶活性测定时，为防止溶血或其他因素对酶活性的影响，所用的所有器皿应清洗干 净、干燥后使用，试剂配制、用量、pH 值、反应时间和温度等均要严格控制。 6．一般正常人每毫升血清中 ALT 活性小于 40 U。 【思考题】 1．制作的标准曲线可测范围是多少？如果样品管的吸光度值超出可测范围的上限，应该怎样 处理？ 2．底物液配制时为什么不能使用 D-氨基酸？ 3．可以采取哪些措施减少 α-酮戊二酸对丙酮酸测定的干扰？ （李梨） 实验五、胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素 【实验目的】 1．掌握影响酶作用的因素。 2．熟悉胰酶对蛋白质的消化作用。 【实验原理】
蛋白质或者多肽物质在蛋白水解酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、羧基肽酶等） 的作用下水解肽键，生成小分子肽或氨基酸。蛋白水解酶对所催化水解的肽键具有选择性，要使 消化道中的蛋白质彻底水解为氨基酸，需要多种蛋白水解酶共同作用。胰蛋白酶能催化蛋白质水 解，对由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键、酯键有高度特异 性。本实验以曝光定影照相底片上的白明胶作为蛋白质底物，观察动物胰酶对蛋白质的消化作用。 随着白明胶的不断水解，已还原的银颗粒（黑色）逐渐从底片片基上脱落下来，底片逐渐变透明。 根据底片是否变透明以及变透明的程度来判断胰酶活性的高低。如果酶活性很低，白明胶没有被 消化，则底片仍然是黑色。若白明胶完全被消化，则底片完全变透明。 酶是生物催化剂，是活细胞产生的具有高特异性和高效性的蛋白质，几乎参与所有的生命活 动过程。酶的活性受到多种因素的影响。这些因素主要包括酶浓度、底物浓度、温度、H、抑制 剂和激活剂等。 酶浓度对酶活性有明显影响。在酶促反应系统中，当底物浓度远远超过酶浓度时，酶促反应 速度与酶浓度成正比关系。酶促反应速度随着酶浓度的增加而加快，随着酶浓度的降低而减慢。 温度对酶活性有显著影响。低温时酶反应速度缓慢。当温度逐渐升高时，与一般化学催化剂 一样，酶促反应速度随温度升高而加快。达到某一温度时，酶促反应速度最大，酶活性最高，此 温度称为酶的最适温度(optimum temperature)。高于此温度，温度升高加速酶蛋白的变性，酶促 反应速度随温度上升而减慢。以温度对酶促反应速度作图，可得到钟罩形（倒U形）曲线，反映 了温度对酶促反应速度的双重影响。值得注意的是：低温时酶活性虽然很低，但酶很稳定，不容 易发生变性。温度回升后，酶可以恢复活性。这是低温麻醉、低温提取和保存酶及蛋白质类制品 的原因。 酶的最适温度对于酶不是一个特征性常数，它与反应的条件（如作用时间的长短、底物浓度、 酶浓度、H值等)有关。较短时间内酶可以耐受较高温度，如果延长反应时间，酶的最适温度降 低。各种酶都有自己的最适温度。大多数动物来源的酶，其最适温度多在37℃~40℃之间。 环境pH对酶活性也有显著影响。酶蛋白只有处于特定的解离状态下，才能和底物结合。酶反 应体系的H可以影响酶分子的构象和稳定性，特别是影响酶分子活性中心上必需基团的解离，也 影响底物和辅酶的解离状态，从而影响酶与底物的结合，影响酶活性。酶通常只有在一定的H范 围内才表现出酶活性。过酸或过碱容易使酶蛋白变性失活。以pH对酶促反应速度作图，可得到钟 罩形曲线。其中，酶表现出最高活性时的pH称为酶的最适pH(optimum pH)。pH高于或低于最适 pH,酶活性降低甚至丧失。 酶的最适pH对于酶不是一个特征性常数，它受底物的性质和浓度、缓冲液的性质和浓度、酶 的纯度等多种因素影响。不同的酶最适pl各不相同，例如胃蛋白酶的最适pH为1.5~2.5，胰蛋 白酶的最适pH值为8.0左右。 酶的活性还受激活剂或抑制剂的影响。重金属离子、有机磷化合物等是胰蛋白酶的抑制剂。 【实验材料与仪器】 1.器材： 曝光定影的照相底片（剪成8mm×l2mm的同等大小）、试管及试管架、吸量管、恒温水浴箱、 电热水浴锅、冰浴。 2.试剂： (1)胰酶溶液：称取胰酶粉0.13g,加蒸馏水100ml。用磁力搅拌器搅拌20min,使之完全 溶解。根据所需底片透明的时间，各实验室可适当调整胰酶溶液的配制浓度。临用前配制，4℃保 存备用。 (2)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH5.0) (3)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0) (4)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH10.0) 11
11 蛋白质或者多肽物质在蛋白水解酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、羧基肽酶等） 的作用下水解肽键，生成小分子肽或氨基酸。蛋白水解酶对所催化水解的肽键具有选择性，要使 消化道中的蛋白质彻底水解为氨基酸，需要多种蛋白水解酶共同作用。胰蛋白酶能催化蛋白质水 解，对由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键、酯键有高度特异 性。本实验以曝光定影照相底片上的白明胶作为蛋白质底物，观察动物胰酶对蛋白质的消化作用。 随着白明胶的不断水解，已还原的银颗粒（黑色）逐渐从底片片基上脱落下来，底片逐渐变透明。 根据底片是否变透明以及变透明的程度来判断胰酶活性的高低。如果酶活性很低，白明胶没有被 消化，则底片仍然是黑色。若白明胶完全被消化，则底片完全变透明。 酶是生物催化剂，是活细胞产生的具有高特异性和高效性的蛋白质，几乎参与所有的生命活 动过程。酶的活性受到多种因素的影响。这些因素主要包括酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制 剂和激活剂等。 酶浓度对酶活性有明显影响。在酶促反应系统中，当底物浓度远远超过酶浓度时，酶促反应 速度与酶浓度成正比关系。酶促反应速度随着酶浓度的增加而加快，随着酶浓度的降低而减慢。 温度对酶活性有显著影响。低温时酶反应速度缓慢。当温度逐渐升高时，与一般化学催化剂 一样，酶促反应速度随温度升高而加快。达到某一温度时，酶促反应速度最大，酶活性最高，此 温度称为酶的最适温度（optimum temperature）。高于此温度，温度升高加速酶蛋白的变性，酶促 反应速度随温度上升而减慢。以温度对酶促反应速度作图，可得到钟罩形（倒 U 形）曲线，反映 了温度对酶促反应速度的双重影响。值得注意的是：低温时酶活性虽然很低，但酶很稳定，不容 易发生变性。温度回升后，酶可以恢复活性。这是低温麻醉、低温提取和保存酶及蛋白质类制品 的原因。 酶的最适温度对于酶不是一个特征性常数，它与反应的条件（如作用时间的长短、底物浓度、 酶浓度、pH 值等）有关。较短时间内酶可以耐受较高温度，如果延长反应时间，酶的最适温度降 低。各种酶都有自己的最适温度。大多数动物来源的酶，其最适温度多在 37℃～40℃之间。 环境 pH 对酶活性也有显著影响。酶蛋白只有处于特定的解离状态下，才能和底物结合。酶反 应体系的 pH 可以影响酶分子的构象和稳定性，特别是影响酶分子活性中心上必需基团的解离，也 影响底物和辅酶的解离状态，从而影响酶与底物的结合，影响酶活性。酶通常只有在一定的 pH 范 围内才表现出酶活性。过酸或过碱容易使酶蛋白变性失活。以 pH 对酶促反应速度作图，可得到钟 罩形曲线。其中，酶表现出最高活性时的 pH 称为酶的最适 pH（optimum pH）。pH 高于或低于最适 pH，酶活性降低甚至丧失。 酶的最适 pH 对于酶不是一个特征性常数，它受底物的性质和浓度、缓冲液的性质和浓度、酶 的纯度等多种因素影响。不同的酶最适 pH 各不相同，例如胃蛋白酶的最适 pH 为 1.5～2.5，胰蛋 白酶的最适 pH 值为 8.0 左右。 酶的活性还受激活剂或抑制剂的影响。重金属离子、有机磷化合物等是胰蛋白酶的抑制剂。 【实验材料与仪器】 1．器材： 曝光定影的照相底片（剪成 8mm×12mm 的同等大小）、试管及试管架、吸量管、恒温水浴箱、 电热水浴锅、冰浴。 2．试剂： （1）胰酶溶液：称取胰酶粉 0.13 g，加蒸馏水 100 ml。用磁力搅拌器搅拌 20 min，使之完全 溶解。根据所需底片透明的时间，各实验室可适当调整胰酶溶液的配制浓度。临用前配制，4℃保 存备用。 （2）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH5.0） （3）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH8.0） （4）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH10.0）
(5)0.2 mol/L HgC2溶液：称取HgC25.43g,加蒸馏水溶解，定容至100ml。储存于棕色瓶 中，4℃保存备用。注意：此溶液是含汞的剧毒试剂，操作时要特别小心。 (6)0.2mol/LNaC溶液 【实验步骤】 1.酶浓度对酶活性的影响 (1)取试管4支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-4酶浓度对酶活性的影响 试管编号 试剂 1 4 胰酶溶液/ml 1.5 1.0 0.5 一 蒸馏水/ml 0.5 1.0 1.5 磷酸缓冲液(pH8.0)/ml 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀，40℃水浴保温3min。 放入相同大小曝光定影底片1张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 40℃水浴保温。 (2)密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 (3)当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 (4)取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 (5)比较各管底片的变化，解释结果。 2.温度对酶活性的影响 (1)取试管4支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-5温度对酶活性的影响 试管编号 试剂 1 2 3 4 胰酶溶液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 磷酸缓冲液(pH8.0)ml 3.0 3.0 3.0 3.0 100℃水浴加 40℃水浴保冰浴放置20冰浴放置20 热20min 温20min min min 放入相同大小曝光定影底片1张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 保温观察 40℃水浴 40℃水浴 40℃水浴 冰浴 (2)密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 (3)当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 (4)取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 (5)比较各管底片的变化，解释结果。 3.pH对酶活性的影响 (1)取试管3支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-6p对酶活性的影响 试管编号 试剂 1 2 3 胰酶溶液/ml 1.0 1.0 1.0 磷酸缓冲液(pH5.0)ml 3.0 磷酸缓冲液(pH8.0)ml 3.0 12
12 （5）0.2 mol/L HgCl2 溶液：称取 HgCl25.43 g，加蒸馏水溶解，定容至 100 ml。储存于棕色瓶 中，4℃保存备用。注意：此溶液是含汞的剧毒试剂，操作时要特别小心。 （6）0.2 mol/L NaCl 溶液 【实验步骤】 1．酶浓度对酶活性的影响 （1）取试管 4 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-4 酶浓度对酶活性的影响 试剂 试管编号 1 2 3 4 胰酶溶液/ml 1.5 1.0 0.5 — 蒸馏水/ml — 0.5 1.0 1.5 磷酸缓冲液（pH8.0）/ml 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀，40℃水浴保温 3 min。 放入相同大小曝光定影底片 1 张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 40℃水浴保温。 （2）密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 （3）当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 （4）取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 （5）比较各管底片的变化，解释结果。 2．温度对酶活性的影响 （1）取试管 4 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-5 温度对酶活性的影响 试剂 试管编号 1 2 3 4 胰酶溶液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 磷酸缓冲液（pH8.0）/ml 3.0 3.0 3.0 3.0 100℃水浴加 热 20 min 40℃ 水浴保 温 20 min 冰浴放置 20 min 冰浴放置 20 min 放入相同大小曝光定影底片 1 张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 保温观察 40℃水浴 40℃水浴 40℃水浴 冰浴 （2）密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 （3）当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 （4）取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 （5）比较各管底片的变化，解释结果。 3．pH 对酶活性的影响 （1）取试管 3 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-6 pH 对酶活性的影响 试剂 试管编号 1 2 3 胰酶溶液/ml 1.0 1.0 1.0 磷酸缓冲液（pH5.0）/ml 3.0 — — 磷酸缓冲液（pH8.0）/ml — 3.0 —
磷酸缓冲液(pH10.0)ml 3.0 混匀，40℃水浴保温3min。 放入相同大小曝光定影底片1张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 40℃水浴保温。 (2)密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 (3)当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 (4)取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 (5)比较各管底片的变化，解释结果。 4.抑制剂对酶活性的影响 (1)取试管3支，编号，按下表所列步骤操作。 表1-7抑制剂对酶活性的影响 试管编号 试剂 1 3 胰酶溶液/ml 1.0 1.0 1.0 磷酸缓冲液(pH8.0)ml 3.0 3.0 3.0 0.2mol/LNaC1溶液/滴 3 0.2mol/L HgCI2.溶液/滴 3 混匀，40℃水浴保温3min。 放入相同大小曝光定影底片1张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 40℃水浴保温。 (2)密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 (3)当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 (4)取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 (5)比较各管底片的变化，解释结果。 【注意事项】 1.在研究某一因素对酶活性的影响时，需要严格控制反应中其它因素保持不变，只改变要研 究的某一种因素。 2.在进行酶活性分析时，所用的试管应洁净干燥。 3.掌握好水解程度是本实验的关键之一。 4.各溶液的加样量应准确。 5.同组的各管反应时间应一致。 6.HgC2溶液含汞，有剧毒，操作时要小心谨慎，严防中毒。凡接触过此溶液的所有器皿应 彻底清洗干净，以免影响其他酶学实验。 【思考题】 1.除了本实验中观察的因素以外，影响酶活性的因素还有哪些？ 2.酶反应的最适温度是一个常数吗？它和哪些因素有关？高温和低温对酶活性的影响有何不 同？ 3.在抑制剂对酶活性的影响实验中，设立的1、2、3号试管分别起什么作用？ (李梨) 实验六、酶的竞争性抑制作用 13
13 磷酸缓冲液（pH10.0）/ml — — 3.0 混匀，40℃水浴保温 3 min。 放入相同大小曝光定影底片 1 张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 40℃水浴保温。 （2）密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 （3）当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 （4）取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 （5）比较各管底片的变化，解释结果。 4．抑制剂对酶活性的影响 （1）取试管 3 支，编号，按下表所列步骤操作。 表 1-7 抑制剂对酶活性的影响 试剂 试管编号 1 2 3 胰酶溶液/ml 1.0 1.0 1.0 磷酸缓冲液（pH8.0）/ml 3.0 3.0 3.0 0.2 mol/L NaCl 溶液/滴 — 3 — 0.2 mol/L HgCl2 溶液/滴 — — 3 混匀，40℃水浴保温 3 min。 放入相同大小曝光定影底片 1 张，记录时间。注意：反应溶液应该完全浸没底片。 40℃水浴保温。 （2）密切观察各管中底片的变色情况以及溶液的性状变化（间歇摇动试管）。 （3）当某一试管中的底片刚刚变为透明时，迅速取出各管。小心将各管的溶液倒去，注意不 要将底片倒出，以蒸馏水反复冲洗底片以去除胰酶。 （4）取出各管底片，晾干，按顺序贴在实验报告纸上。注意不要将底片顺序弄混。 （5）比较各管底片的变化，解释结果。 【注意事项】 1．在研究某一因素对酶活性的影响时，需要严格控制反应中其它因素保持不变，只改变要研 究的某一种因素。 2．在进行酶活性分析时，所用的试管应洁净干燥。 3．掌握好水解程度是本实验的关键之一。 4．各溶液的加样量应准确。 5．同组的各管反应时间应一致。 6．HgCl2 溶液含汞，有剧毒，操作时要小心谨慎，严防中毒。凡接触过此溶液的所有器皿应 彻底清洗干净，以免影响其他酶学实验。 【思考题】 1. 除了本实验中观察的因素以外，影响酶活性的因素还有哪些？ 2. 酶反应的最适温度是一个常数吗？它和哪些因素有关？高温和低温对酶活性的影响有何不 同？ 3. 在抑制剂对酶活性的影响实验中，设立的 1、2、3 号试管分别起什么作用？ （李梨） 实验六、酶的竞争性抑制作用