将结品紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 ②革兰氏碘液：碘1.0g,碘化钾20g 荒水300m. 将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振荡，待完全溶解后，再加入蒸馆 水至300mL ③沙黄复染液：沙黄0.25g,95%乙醇10mL,燕馏水90mL。将沙黄溶于乙醇中， 然后再用蒸馏水稀释。 (一)大肠菌群MPN计数法（第一法） 大肠菌群MPN计数法的检验程序见图12-1。 1.操作步骤 (1)检样稀释 ①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均 质杯内，8000-10000rmin均质1min-2min.或放入盛有225mL稀释液的无南均质袋 中，用拍击式均质器拍打1mm ②液体样品： 以无菌 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无南玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 ③样品匀液的pH应在6.5~7.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HC1调 节。 ④用1mL无南吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀 释液的无茵试管中( 注意吸管或吸头尖端不触及稀释液面) ,振摇试管或换用1支无菌吸 管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液 ⑤另取1mL无菌吸管或微量移液器，按上条操作方法，做10倍系列稀释液。每递增稀 释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。 (2)初发酵试验：根据对检样污染状况的估计，洗择3个活官稀释度的样品匀液（液 体样品可以选择原液) 每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，每管 (如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤)，36C±1C培养2 h2h,观察倒管内是 否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h+2h,产气者进 行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 (3)复发酵试验：用接种环从产气的ST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳 糖胆盐肉汤(BGLB)管中，36℃±1℃培养482h,观察产气情况。产气者，计为大肠菌 群阳性管 (4)大肠菌群最可能数(MPN)的报告：按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN 表（表1-2-1），报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPW值
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 ② 革兰氏碘液：碘 1.0 g，碘化钾 2.0 g，蒸馏水 300 mL。 将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振荡，待完全溶解后，再加入蒸馏 水至 300 mL。 ③ 沙黄复染液：沙黄 0.25 g，95%乙醇 10 mL，蒸馏水 90 mL。将沙黄溶于乙醇中， 然后再用蒸馏水稀释。 （一）大肠菌群MPN计数法（第一法） 大肠菌群MPN计数法的检验程序见图1-2-1。 1. 操作步骤 （1）检样稀释 ① 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均 质杯内，8 000～10 000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。 ② 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 ③ 样品匀液的pH 应在6.5～7.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 ④ 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀 释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸 管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 ⑤ 另取1mL无菌吸管或微量移液器，按上条操作方法，做10倍系列稀释液。每递增稀 释一次，换用1次1 mL 无菌吸管或吸头。 （2）初发酵试验：根据对检样污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液 体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接 种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是 否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进 行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 （3）复发酵试验：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳 糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌 群阳性管。 （4）大肠菌群最可能数（MPN）的报告：按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN 表（表1-2-1），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值
25g(mL样品+225mL稀释液，均质 10倍系列稀释 选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管 36C±1℃48d2h 不产气 产气 GLB肉汤 36℃±1℃4gh42 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 查MPN表 报告结果 图1-21大肠菌群MPN计数法检验程序 (二)大肠菌群平板计数法（第二法） 大肠菌群平板计数法的检验程序见图1-2-2。 L.操作步骤 (1)样品的稀释：按大肠菌群MPN计数法进行。 (2)平板计数 ①根据对检样污染状况的估计，选取2一3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个 无菌平皿，每皿1ml。同时取1L生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 ②及时将15mL~20mL冷至46C±1℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL一4mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36C±1C培养18h~24h。 (3)平板菌落数的选择：选取菌落数在15C℉U~150C℉U之间的 ，分别计数平 上出现的典型可聚大肠菌商家·臭面客为紫红色，菌陈周同有红色的测盖沉淀不 菌落直径为0.5mm或更大。 (4)证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报 为大肠菌群阳性 (5)大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的 板典型和可疑菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例如，10样 品稀释液1mL,在VRBA平板上有1O0个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤
（二）大肠菌群平板计数法（第二法） 大肠菌群平板计数法的检验程序见图 1-2-2。 1. 操作步骤 （1）样品的稀释：按大肠菌群MPN计数法进行。 （2）平板计数 ① 根据对检样污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个 无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 ② 及时将15 mL～20 mL冷至46℃±1℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18 h～24 h。 （3）平板菌落数的选择：选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板 上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环， 菌落直径为0.5 mm或更大。 （4）证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报 告为大肠菌群阳性。 （5）大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平 板典型和可疑菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例如，10-4样 品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤 检 样 25 g (mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管 36℃±1℃ 产气 BGLB 肉汤 不产气 产 气 48h±2h 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 查 MPN 表 报告结果 36℃±1℃ 48h±2h 图1-2-1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序
管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10x10g(mL)=6.0×10CFUg (mL) 10倍系列稀释 选择2一3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板 36℃1℃18h~24h 计数典型和可疑菌落 BGLB肉汤 36c+124h-48 报告结果 图12-2大肠菌群平板计数法检验程序 表1-21大肠菌群最可能数(MPN)检索表 阳性管 95%可信限 0.10 0.001 MPN 0.01 下限 上限 0 0 0 9.5 0 0 0 015 3 0 0 18 0 0 1 0 88 1 0 0 7.4 613 2 1 11 ( 562 2 66515455 2 2 2 405022 8222582222424 22 35 87
管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104 /g（mL）=6.0×105CFU/g （mL）。 、 表 1-2-1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 95%可信限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0 0 0 <3.0 — 9.5 0 0 1 3.0 0.15 9.6 0 1 0 3.0 0.15 11 0 1 1 6.1 1.2 18 0 2 0 6.2 1.2 18 0 3 0 9.4 3.6 38 1 0 0 3.6 0.17 18 1 0 1 7.2 1.3 18 1 0 2 11 3.6 38 1 1 0 7.4 1.3 20 1 1 1 11 3.6 38 1 2 0 11 3.6 42 1 2 1 15 4.5 42 1 3 0 16 4.5 42 2 0 0 9.2 1.4 38 2 0 1 14 3.6 42 2 0 2 20 4.5 42 2 1 0 15 3.7 42 2 1 1 20 4.5 42 2 1 2 27 8.7 94 2 2 0 21 4.5 42 2 2 1 28 8.7 94 2 2 2 35 8.7 94 检 样 25 g(mL)样品+225mL 稀释液,均质 10 倍系列稀释 选择 2～3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板 36℃±1℃ 计数典型和可疑菌落 BGLB 肉汤 报告结果 18h～24h 36℃±1℃ 24h～48h 图 1-2-2 大肠菌群平板计数法检验程序
3 0 29 8.7 3 36 8 、2 0 46 3 3 64 17 3 0 9 120 3 3 160 0 9 18 420 150 37 420 210 40 430 290 1.00 3 0 240 42 1.0m 3 3 46n 3.000 3 1100 180 4,100 >1100 420 注：①本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001gmlL小，每个稀释度接种3管.②表内 所列检样量如政用g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时。 表内数 应相应降低10倍：如改用001g(mL) 0.001g(ml、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 三、动物性食品中沙门氏菌的检验 沙门氏菌属(Salmor ell@)是肠杆菌科的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属，沙 门氏菌屈(Salmonella)为肠杆菌科中的一个大属，仅包括2个种，即肠道沙门氏南(S.enterica) 和博恩格律沙门氏菌(S.bongori)。引起人和食品动物发生感染最常见的属于肠道亚种。沙 门氏菌约有2000多个血清型和变种，我国已发现120多个血清型。本属细菌绝大多数成员 对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与目肠炎，其至流产，并能引起人类食物中 毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原茵之 世界各地的食物中毒病例中，英国、中国 沙门氏菌食物中毒居首位，美国沙门氏菌食物中毒居第二位。沙门氏菌常作为食品致病菌指 标。食品中沙门氏菌检验按GB4789.4一2010《食品安全国家标淮食品微生物学检验沙门 氏菌检验》进行。 1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设各外，其他设备和材料如下： (2)恒温培养箱：36C±1C,42℃±1℃ (3)均质器。 (4)振荡器。 (5)电子天平：感量01g (6)无菌锥形瓶：容量500mL,250mL (7)无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及 吸头 (8)无菌培养皿：直径90mm。 (9)无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 (10)无南毛细管。 (II)pH计或pH比色管或精密pH试纸。 (12)全自动微生物生化鉴定系统
2 3 0 29 8.7 94 2 3 1 36 8.7 94 3 0 0 23 4.6 94 3 0 1 38 8.7 110 3 0 2 64 17 180 3 1 0 43 9 180 3 1 1 75 17 200 3 1 2 120 37 420 3 1 3 160 40 420 3 2 0 93 18 420 3 2 1 150 37 420 3 2 2 210 40 430 3 2 3 290 90 1，000 3 3 0 240 42 1，000 3 3 1 460 90 2，000 3 3 2 1100 180 4，100 3 3 3 >1100 420 -- 注：①本表采用3个稀释度[0.1g (mL)、0.01 g (mL)和 0.001 g (mL)]，每个稀释度接种 3 管。②表内 所列检样量如改用lg（mL）、0.1 g (mL)和0.01g (mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用 0.01g (mL)、 0.001g (mL)、0.0001g (mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 三、动物性食品中沙门氏菌的检验 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属，沙 门氏菌属（Salmonella）为肠杆菌科中的一个大属，仅包括 2 个种，即肠道沙门氏菌（S.enterica） 和博恩格律沙门氏菌（S.bongori）。引起人和食品动物发生感染最常见的属于肠道亚种。沙 门氏菌约有 2 000 多个血清型和变种，我国已发现 120 多个血清型。本属细菌绝大多数成员 对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中 毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。世界各地的食物中毒病例中，英国、中国 沙门氏菌食物中毒居首位，美国沙门氏菌食物中毒居第二位。沙门氏菌常作为食品致病菌指 标。食品中沙门氏菌检验按 GB 4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门 氏菌检验》进行。 1. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）冰箱：2℃～4℃。 （2）恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 （3）均质器。 （4）振荡器。 （5）电子天平：感量0.1 g。 （6）无菌锥形瓶：容量500 mL，250 mL。 （7）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及 吸头。 （8）无菌培养皿：直径90 mm。 （9）无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 （10）无菌毛细管。 （11）pH计或pH比色管或精密pH 试纸。 （12）全自动微生物生化鉴定系统