率可用蛋白总浓度来表示，可用于细胞毒性的常规筛检。此外，前述评价细胞特性的指标 如形态学和接种效率等 均可采用 (2细胞膜损伤：可选择台盼蓝摄取、胞浆酶漏出、C的释放以及钙泵的变化等指标 来评价细胞膜的损伤。 (③)大分子物质合成与降解的改变：可选用C亮氨酸蛋白试验和H田尿嘧啶参入RNA 试验等指标，以判断受试物对培养细胞的大分子合成与降解的有无作用！ ④代谢能力：除可选择AP浓度、NADP/N 含量、氧消耗量等 指标外，还有毒物代谢降的活性 ADPH比 、谷胱甘 细胞膜脂质过氧化作用及“C葡萄糖氧化代谢成1“C0 的速率，均可反映出细胞的代谢能力。 (⑤形态学观察：通过光学显微镜和电子显微镜观察，可了解受试物对培养细胞的形态 改变情况。 第三节亚细胞组分制备及其检测方法 细胞由许多亚细胞组分组成，如核、线粒体、内质网膜、溶酶体及高尔基氏体等，它们 在维持细胞正常生理功能方面起者重要的作用。故许多外源化学物引起机体的损害作用，有 可能与亚细胞组分的结构与功能损伤有关。在走理学中，亚细胞组分作为遗传毒性剩定中的 代谢活化系统，如S9己普遍运用。此外，亚细胞组分主要用于中毒机理的分子水平研究 因它们是从整体细胞上在自然环境下分离出来的，使毒理学家在体外条件下，有可能更深 了解外源化学物在毒作用部位的作用机理。但它离开子整体细胞，也有其局限性：即它仅提 供有关一些特殊作用能力的特定信息。对外源化学物毒作用机理研究，还应结合其它研究如 整体试验、细胞试验等，综合作出评价。现就微粒体和线粒体的制备及其检测方法加以介绍 、基本技术 (一)设备 L.匀浆器(homogenizer)常用匀浆器为Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管组成。 它是利用两者的间隙将细胞破碎，其间隙一般在0.15-0.25m。杵是由马达传动，其速度在 2000m以内，且可调节。它较适合肝细胞、肾细胞及脑细胞的破碎，而对肺、甲状腺等结 筛组织较多的组织效果不佳。匀浆器可从5ml至50ml大小不等，依实验需要加以选择。使 用本法破碎细胞应注意： ①在低温下操作避免匀浆磨擦生热和室温影响实验结果：②马达速 度不宜过快，慢速可获更大的扭力矩：③匀浆上下次数，即杵由玻璃套管上部下到底部，再 回到上部，一般肝细胞匀浆上下8~10次即可达到破碎目的。 2.离心机是亚细胞组分制备的关键设备，一般需要低温高速离心机，最大转速为18 000~24000pm,和超速离心机，最大转速为50000~75000rpm。离心机应配各各种类型的 转头，以供 亚细胞组分制各时差速离心选用。离心管最好为聚丙烯的，因其透明性较好。 (仁)匀浆介 质和缓冲液 最常用的匀浆介质为等渗的蔗糖(0.25mol/L)和氯化钾(0.154mol/L)。蔗糖为经典亚细 胞组分分离研究所选用，而氯化钾更适合外源化学物代谢酶的研究，如它可更有效除去微粒 体制备物中的血红蛋白，减少光谱测定的干扰。匀浆介质在使用前应将H调至7.4左右。 匀浆缓冲液可含有5-50mmol/L的Tris或Hepe 常 的匀浆缓冲液为含0.1 l/LKC的50mmol/LTris·HCI缓冲 液，pH7.4。此缓冲液在4℃条件下，至少贮存12周不变质。 (三)生物样品 实验动物如大鼠、小鼠、金黄地鼠应迅速处死，常用的方法是断头处死。应避免使用麻 醉剂，如乙酰、巴比妥类药物，它们将影响毒物代谢酶的活力。对于大实验动物，如狗等
率可用蛋白总浓度来表示，可用于细胞毒性的常规筛检。此外，前述评价细胞特性的指标， 如形态学和接种效率等，均可采用。 (2) 细胞膜损伤：可选择台盼蓝摄取、胞浆酶漏出、Ca2+的释放以及钙泵的变化等指标 来评价细胞膜的损伤。 (3) 大分子物质合成与降解的改变：可选用[ 14C]亮氨酸蛋白试验和[ 3H]尿嘧啶参入 RNA 试验等指标，以判断受试物对培养细胞的大分子合成与降解的有无作用。 (4) 代谢能力：除可选择 ATP 浓度、NADP／NADPH 比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等 指标外，还有毒物代谢酶的活性、细胞膜脂质过氧化作用及[ 14C]-葡萄糖氧化代谢成 14CO2 的速率，均可反映出细胞的代谢能力。 (5) 形态学观察：通过光学显微镜和电子显微镜观察，可了解受试物对培养细胞的形态 改变情况。 第三节 亚细胞组分制备及其检测方法 细胞由许多亚细胞组分组成，如核、线粒体、内质网膜、溶酶体及高尔基氏体等，它们 在维持细胞正常生理功能方面起着重要的作用。故许多外源化学物引起机体的损害作用，有 可能与亚细胞组分的结构与功能损伤有关。在毒理学中，亚细胞组分作为遗传毒性测定中的 代谢活化系统，如 S9 已普遍运用。此外，亚细胞组分主要用于中毒机理的分子水平研究， 因它们是从整体细胞上在自然环境下分离出来的，使毒理学家在体外条件下，有可能更深入 了解外源化学物在毒作用部位的作用机理。但它离开子整体细胞，也有其局限性；即它仅提 供有关一些特殊作用能力的特定信息。对外源化学物毒作用机理研究，还应结合其它研究如 整体试验、细胞试验等，综合作出评价。现就微粒体和线粒体的制备及其检测方法加以介绍。 一、基本技术 (一) 设备 1. 匀浆器(homogenizer) 常用匀浆器为 Potter 型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管组成。 它是利用两者的间隙将细胞破碎，其间隙一般在 0.15~0.25nm。杵是由马达传动，其速度在 2000rpm 以内，且可调节。它较适合肝细胞、肾细胞及脑细胞的破碎，而对肺、甲状腺等结 缔组织较多的组织效果不佳。匀浆器可从 5ml 至 50ml 大小不等，依实验需要加以选择。使 用本法破碎细胞应注意：①在低温下操作避免匀浆磨擦生热和室温影响实验结果；②马达速 度不宜过快，慢速可获更大的扭力矩；③匀浆上下次数，即杵由玻璃套管上部下到底部，再 回到上部，一般肝细胞匀浆上下 8~10 次即可达到破碎目的。 2. 离心机 是亚细胞组分制备的关键设备，一般需要低温高速离心机，最大转速为 18 000～24000rpm，和超速离心机，最大转速为 50000～75000rpm。离心机应配备各种类型的 转头，以供亚细胞组分制备时差速离心选用。离心管最好为聚丙烯的，因其透明性较好。 (二) 匀浆介质和缓冲液 最常用的匀浆介质为等渗的蔗糖(0.25mol／L)和氯化钾(0.154mol／L)。蔗糖为经典亚细 胞组分分离研究所选用，而氯化钾更适合外源化学物代谢酶的研究，如它可更有效除去微粒 体制备物中的血红蛋白，减少光谱测定的干扰。匀浆介质在使用前应将 pH 调至 7.4 左右。 匀浆缓冲液可含有 5~50mmol／L 的 Tris 或 Hepes。 大多数研究中常用的匀浆缓冲液为含 0.154mol／L KCl 的 50mmol／L Tris·HCI 缓冲 液，pH7.4。此缓冲液在 4℃条件下，至少贮存 12 周不变质。 (三) 生物样品 实验动物如大鼠、小鼠、金黄地鼠应迅速处死，常用的方法是断头处死。应避免使用麻 醉剂，如乙醚、巴比妥类药物，它们将影响毒物代谢酶的活力。对于大实验动物，如狗等
应在话当的麻醉条件下，放血处死。尽快取出所需脏器，如肝、肾、肺及脑等，置人冰的匀 浆介质中。为了减少实验误差，应参考动物的年龄、性别、品系、健康状况、饮食类型和 养环境等因素 为避免昼夜节律影响， 每次实验应在相同时间处死动物。为避免肝 原影阿，大鼠应禁食过夜。 (四)微粒体酶的诱导方法 1.苯巴比妥钠它是常用的诱导剂之一。其方法是以小鼠80mg/kg·d山，大鼠100m9 效果。主 诱导细胞色素P.450 2.p萘黄刷(B-naphthoflavone)它是多环芳烃类的诱导物，可诱导细胞色素P448,同 类诱导物还有3.甲基胆葸(3-methylcholanthrene)。B-萘黄酮的使用方法是小鼠40mg (kg·d),大鼠80mg/(kg·d),经腹腔注射，连续3~4天，即可达到诱导作用。主要诱导 细胞色素P448。 3.多氯联苯常用多氯联苯诱导物是Arochlor254,它是混合型的诱导物，即同时诱号 细胞色素P450和细胞色素P448,剂量依多氯联苯种类不同而异，需做预试验来确定。 二、微粒体的制备 微粒体(microsom©)是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于 微粒体含有混合功能氧化酶，其在毒理学研究中有若重要地位，故微粒体是毒理学中较常用 的体外系统 (一)肝微粒体制备 1.以断头方法处死动物，迅速取出肝脏，用预冷生理盐水或匀浆介质洗净血污，剪去 粘连的组织，用滤纸轻轻吸干表面水分，称重。 2.将肝转入小烧杯，用剪刀剪碎肝脏，加入适当匀浆介质，一般为3ml/g肝脏。放人 Potter匀浆器中，上、下8次，制成肝匀浆。 3.按示意图操作离心。 肝匀桨 离心，10000g20mim 沉 离心，10500g1h 沉淀（微粒体） 上清液弃去 在第一次离心去除线粒体、核等物质时，离心管上层漂浮有脂质层，应用吸管将其除去 再收集上清液。在第二次超速离心后，如为了减少血红蛋白的影响，可加匀浆介质将沉淀重 新悬浮，将所制备的微粒体再洗涤一次。沉淀即微粒体，悬浮于I0mmol/L Hepes·HC 摆冲液.DH7.6.内含0154mol/LKC1.1mm0l/LEDTA和20%甘油.-存于.2070℃或 是液氨中。 应强调的是贮存方式和时间对微粒体酶的活性或特征会有不同程度的影响 4.其它方法除超速离心法制备微粒体外，还有凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法 也可以制得微粒体。凝胶过滤法不适于做多个样品。钙沉淀法适于没有超速离心机的实验室 使用。其方法是在去线粒体的上清液中加入钙离子，使其终浓度为8mmol/LCaC2,此时， 内质网部分产生钙依撞性聚集，在较低的离心条件，2000-25000g,20min即可将其沉淀。 不足之处是钙离子可影响某些酶的活性以及造成核糖体的丢失。等电点沉淀法是利用H改 变，使微粒体沉淀出来，弃去线粒体的上清液用醋酸缓冲液把pH调至5.5时，在较低离心
应在适当的麻醉条件下，放血处死。尽快取出所需脏器，如肝、肾、肺及脑等，置人冰的匀 浆介质中。为了减少实验误差，应参考动物的年龄、性别、品系、健康状况、饮食类型和饲 养环境等因素。此外，为避免昼夜节律影响，每次实验应在相同时间处死动物。为避免肝糖 原影响，大鼠应禁食过夜。 (四) 微粒体酶的诱导方法 1. 苯巴比妥钠 它是常用的诱导剂之一。其方法是以小鼠 80mg／(kg·d)，大鼠 100mg ／(kg·d)，经腹腔注射或与生理盐水混合灌胃，连续 3~5 天即可诱导细胞色素 P-450 的活 力。还可以将药溶于饮水，1ng／ml，大约 7 天后，可达到诱导效果。主要诱导细胞色素 P-450。 2. p-萘黄酮(β-naphthoflavone) 它是多环芳烃类的诱导物，可诱导细胞色素 P448，同 类诱导物还有 3-甲基胆葸(3-methylcholanthrene)。β-萘黄酮的使用方法是小鼠 40mg／ (kg·d)，大鼠 80mg／(kg·d)，经腹腔注射，连续 3～4 天，即可达到诱导作用。主要诱导 细胞色素 P448。 3. 多氯联苯 常用多氯联苯诱导物是 Arochlorl254，它是混合型的诱导物，即同时诱导 细胞色素 P-450 和细胞色素 P-448，剂量依多氯联苯种类不同而异，需做预试验来确定。 二、微粒体的制备 微粒体(microsome)是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于 微粒体含有混合功能氧化酶，其在毒理学研究中有着重要地位，故微粒体是毒理学中较常用 的体外系统。 (一) 肝微粒体制备 1. 以断头方法处死动物，迅速取出肝脏，用预冷生理盐水或匀浆介质洗净血污，剪去 粘连的组织，用滤纸轻轻吸干表面水分，称重。 2. 将肝转入小烧杯，用剪刀剪碎肝脏，加入适当匀浆介质，一般为 3ml／g 肝脏。放人 Potter 匀浆器中，上、下 8 次，制成肝匀浆。 3. 按示意图操作离心。 肝匀桨 离心，10000g 20 min 上清液 沉淀 离心，10500g 1h 沉淀 （微粒体） 上清液弃去 在第一次离心去除线粒体、核等物质时，离心管上层漂浮有脂质层，应用吸管将其除去， 再收集上清液。在第二次超速离心后，如为了减少血红蛋白的影响，可加匀浆介质将沉淀重 新悬浮，将所制备的微粒体再洗涤一次。沉淀即微粒体，悬浮于 10mmol／L Hepes·HCl 缓冲液，pH7.6，内含 0.154mol／L KCl，l mmol／LEDTA 和 20％甘油，贮存于-20～70℃或 是液氮中。应强调的是贮存方式和时间对微粒体酶的活性或特征会有不同程度的影响。 4. 其它方法 除超速离心法制备微粒体外，还有凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法 也可以制得微粒体。凝胶过滤法不适于做多个样品。钙沉淀法适于没有超速离心机的实验室 使用。其方法是在去线粒体的上清液中加入钙离子，使其终浓度为 8mmol／L CaCl2，此时， 内质网部分产生钙依赖性聚集，在较低的离心条件，2000~25 000g，20min 即可将其沉淀。 不足之处是钙离子可影响某些酶的活性以及造成核糖体的丢失。等电点沉淀法是利用 pH 改 变，使微粒体沉淀出来，弃去线粒体的上清液用醋酸缓冲液把 pH 调至 5.5 时，在较低离心