肝细孢 和皮质细 肺的各种类型细 培养的背根胶质细胞 L细胞 细 由干哺羽细陶作为休外实哈系统的代越性，在素理学中，已有许多不同举型细胸应用 毒理学实验。表123为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。 是建立正在讯速生长的细胞 细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊 毒作用： 二、基本技术 (一)仪器与设备 1.培养箱 般来说，在5%C02,95%空气和99%的相对湿度的条件下，许多细胞可 存活。故细胞培养的关健设备是C02培养箱。其基本要求：①精确地温度控制调节 在土0.5C,箱内祖度的均衡可依赖风扇：②CO2浓度调节，利用C0,传感器监测箱内CO: 浓度：使箱内大气为5%C02,95%空气：③箱内湿度，可用水盘来维持。有的细胞培养可 以不控制CO2分压。例如，原代肝细胞培养，可用LeibovitzL-5介质，不需CO2,而要求散 开培养瓶， 以供给较高的02分压 2.冰箱和冷相 冰箱(4℃)用于存放培养介质，冷柜（一20℃）则存放酶，（如胰蛋白酶） 和某些培养介质如谷氨酸和血清。 3.显微镜最基本的配置是一台简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以 便依据细胞生长状况，讲行调整或对污染讲行补救或处理。讲行讲一步的研究，则需要更言 级的显微镜，例如 相差显微镜或荧光显微镜， 并附有照相装置或摄影装置 + 超净工作台 在没有无菌操作室的条件下：可用超净 无菌操作装置 主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无 菌环境。它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘 过多对净化作用不利，放超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。 5.清洗和消毒设置：培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求温度160℃以上， 最好使用较大规格的 于燥箱， 知650￥ 300 器皿的清洗可用超声波洗涤器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的冲洗装置。金属器械如 解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。 6.培养器皿为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有 透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。主要的塑料瓶皿有：①多孔培养板，其规格 有4孔、6孔、24孔及96孔，它体积小， 克隆的生 长 ②培养叫 规格有直径30mm、60mm及100mm,与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转 等试验：③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有30ml、50ml、100ml及500ml,适于在CO2培养 箱中使用：④其它：族存细胞的塑料安甑及微量加样器头，后者的规格有2001000口】和 u100μ1二种。 玻璃器皿在实验室仍不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：①吸 管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有10ml,5ml和lml 2玻璃瓶 用于配制各种培 养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有500ml、250ml和100ml:
肝癌细胞 肾脏髓质和皮质细胞 肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏细胞 脊髓微血管细胞 脂肪细胞 由于哺乳细胞作为体外实验系统的优越性，在毒理学中，已有许多不同类型细胞应用于 毒理学实验。表 12-3 为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。 利用哺乳动物细胞进行毒理学体外实验有两种方法：一是建立正在迅速生长的细胞株， 用以观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用；二是利用已高度分化的 细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊 毒作用； 二、基本技术 （一） 仪器与设备 1. 培养箱 一般来说，在 5％CO2，95％空气和 99％的相对湿度的条件下，许多细胞可 存活。故细胞培养的关键设备是 CO2 培养箱。其基本要求：①精确地温度控制调节，一般 在土 0.5℃，箱内温度的均衡可依赖风扇；②CO2 浓度调节，利用 CO2 传感器监测箱内 CO2 浓度；使箱内大气为 5％CO2，95％空气；③箱内湿度，可用水盘来维持。有的细胞培养可 以不控制 CO2 分压。例如，原代肝细胞培养，可用 LeibovitzL-5 介质，不需 CO2，而要求敞 开培养瓶，以供给较高的 O2 分压。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培养介质，冷柜(—20℃)则存放酶，(如胰蛋白酶) 和某些培养介质如谷氨酸和血清。 3. 显微镜 最基本的配置是一台简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以 便依据细胞生长状况，进行调整或对污染进行补救或处理。进行进一步的研究，则需要更高 级的显微镜，例如，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。 4. 超净工作台 在没有无菌操作室的条件下；可用超净工作台。它是一无菌操作装置， 主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无 菌环境。它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘 过多对净化作用不利，故超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。 5. 清洗和消毒设置：培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求温度 160℃以上， 最好使用较大规格的干燥箱，如 650×500×500mm。 器皿的清洗可用超声波洗涤器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的冲洗装置。金属器械如 解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。 6. 培养器皿 为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有 透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。主要的塑料瓶皿有；①多孔培养板，其规格 有 4 孔、6 孔、24 孔及 96 孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；②培养皿， 规格有直径 30mm、60mm 及 l00mm，与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转化 等试验；③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有 30ml、50ml、l00ml 及 500ml，适于在 CO2 培养 箱中使用；④其它：冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，后者的规格有 200~1000μ1 和 1 μl~100μl 二种。 玻璃器皿在实验室仍不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：①吸 管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有 l0ml，5ml 和 lml；②玻璃瓶，用于配制各种培 养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有 500ml、250ml 和 l00ml；
③离心管，规格有50ml、10ml和5ml,用于细胞洗涤。 液氨贮存器 贮存细胞多用液氮 液氯温度在1960 ,具有经济、省力和能较好保 持细胞生物学特性的优点。液氮贮存器有25L和50L两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜 瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氨。如有需要可配置贮存器和运输瓶。 8水纯化装置细胞培养对水的要求较高，师常要求使用三次蔬瘤水配制各种培养液 对玻璃器皿也应用纯水洁洗。但是，在细狗培养中，不宜使用去离子独水，因其不能有效地 去除有机物 实验室应配各自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器， 具有蒸馏速度快，使用安全等优点 外购蒸馏水或去离子，应在本实验室重蒸后使用。对水质量应经常检测，如pH和电导系数。 同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。 9.滤过清毒装置培养介质不能经高压蒸汽消毒，而需通过孔径为0.22μ1的滤膜过滤 消毒。滤过消毒装置由抽气泵（水流玻璃抽气泵或真空泵）、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。 10 吸设 离心机，用于对细胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等 平，包括警通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化液及生理盐 水等。 酸度计，用于准确调整各种介质及生理盐水的pH。 电磁搅拌器，微量加样器等。 (二)培养用液 指细胞培养中所使用的溶液，如培养液、消化液、pH调整液、染液及细胞洗涤液等。 培养液的选择取决于细胞生长的要求，故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液，它的主 要成分为平衡盐溶液和活应细胞体外培养的各种溶液。 培养液在制各村程中应格轻作，避免混入杂质。应特别注意下列问题：①容器，应行 细认真清洗，必要时须消毒：②水 次重蒸蒸馏水 ③严格选择品质优良的药品：④制备 好的培养介质要标明名称、配刺日期及配制者：⑤贮存与消毒。 L.平衡盐溶液常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸盐缓冲液(PBS)等。它具有维持渗 透压、控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。它是配制各种增 养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。 2.小牛血清 是细胞培养中最常见的天然培养基，它具有丰富的营养物质，对细胞附 着和保护也有明显的作用。但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不 足。弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。天然培 养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。 3.合成培养基系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。如最简单的MEM Eage培养液，包括12种必需氨基酸、谷氨酸肢和8种维生素。根据需要可添加某些成分 如碳水化合物（葡萄糖、核糖、脱氧核糖及丙酮酸钠等）、核酸的前体物（嘌吟和嘧啶类化合物 及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。 如进行无血清培养，除上述营养成分外，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成 分以促进细胞贴壁。有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。 为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、链霉素及庆 大莓素等 4.消化液进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞， 通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25%或0.125%)和乙二胺四乙酸二钠 (Na-EDTA)溶液(0.02%)。 5.其它p川调整液，为了营养成分稳定和延长贮存时间，配制生理盐溶液，和培养液
③离心管，规格有 50ml、l0ml 和 5ml，用于细胞洗涤。 7. 液氮贮存器 贮存细胞多用液氮，液氮温度在-196℃，具有经济、省力和能较好保 持细胞生物学特性的优点。液氮贮存器有 25L 和 50L 两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜 瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氮。如有需要可配置贮存器和运输瓶。 8. 水纯化装置 细胞培养对水的要求较高，通常要求使用三次蒸馏水配制各种培养液。 对玻璃器皿也应用纯水清洗。但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地 去除有机物。 实验室应配备自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器，具有蒸馏速度快，使用安全等优点。 外购蒸馏水或去离子，应在本实验室重蒸后使用。对水质量应经常检测，如 pH 和电导系数。 同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。 9. 滤过消毒装置 培养介质不能经高压蒸汽消毒，而需通过孔径为 0.22μl 的滤膜过滤 消毒。滤过消毒装置由抽气泵(水流玻璃抽气泵或真空泵)、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。 10. 一般设备 离心机，用于对细胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等。 天平，包括普通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化液及生理盐 水等。 酸度计，用于准确调整各种介质及生理盐水的 pH。 电磁搅拌器，微量加样器等。 (二) 培养用液 指细胞培养中所使用的溶液，如培养液、消化液、pH 调整液、染液及细胞洗涤液等。 培养液的选择取决于细胞生长的要求，故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液，它的主 要成分为平衡盐溶液和适应细胞体外培养的各种溶液。 培养液在制备过程中应严格操作，避免混入杂质。应特别注意下列问题：①容器，应仔 细认真清洗，必要时须消毒；②水，三次重蒸蒸馏水；③严格选择品质优良的药品；④制备 好的培养介质要标明名称、配制日期及配制者；⑤贮存与消毒。 1. 平衡盐溶液 常用的有 Hanks 液、Eagle 液及磷酸盐缓冲液 (PBS)等。它具有维持渗 透压、控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。它是配制各种培 养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。 2. 小牛血清 是细胞培养中最常见的天然培养基，它具有丰富的营养物质，对细胞附 着和保护也有明显的作用。但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不 足。弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。天然培 养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。 3. 合成培养基 系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。如最简单的 MEM Eagle 培养液，包括 12 种必需氨基酸、谷氨酸胺和 8 种维生素。根据需要可添加某些成分， 如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脱氧核糖及丙酮酸钠等)、核酸的前体物(嘌呤和嘧啶类化合物) 及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。 如进行无血清培养，除上述营养成分外，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成 分以促进细胞贴壁。有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。 为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、链霉素及庆 大霉素等。 4. 消化液 进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞， 通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25％或 0.125％)和乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA)溶液(0.02％)。 5. 其它 pH 调整液，为了营养成分稳定和延长贮存时间，配制生理盐溶液，和培养液
时，均在临用前加入NaHCO:溶液。常用浓度有37%、5%和74%。此外，还有HEPES 溶液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间保持恒定的pH值范围。使用终浓度为10~15mm0 染色液：常用的有①苏木精-伊红染色液或称HE染色：②Giemsa染色液。 固定液：常用的有①中性缓冲福尔马林，相当于10%的福尔马林：②Boui氏固定液： ③醋酸甲醇，临用前配制，结合Giemsa染色效果较好：④FAA固定液，由福尔马林、冰醋 酸及80%酒精组成，用于盖片单层培养的固定。 ()消毒技术 在细胞培养中，消毒是最基本的一项工作，它直接影响实验的结果。消毒指施应在细胞 培养的每个环节严格执行。细胞培养的微生物污染，包括细菌、真菌及病毒，它们主要米源 于：操作者的粗心：操作表面或周围的环境：培养液及培养器皿的灭菌不彻底或存放时间过 久等。 对不同的细胞培养所用物品，可采用不同的消毒灭菌的方法 一般有两类 ,是物 菌法 ,即利用紫外线、干热及微孔过滤等：二是化学灭南法，即利用化学清毒剂。主要消毒 方面法介绍如下： 1.紫外线适于消毒空气、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培养板等， 使用方便，效果较好。应注意其可产生臭氧，影向健康」 2.高压燕气消毒它适于金属器械、胶塞、布类及某些培养液。 一般要求15陪压力下 20min。或者更简单的 煮沸消毒，其不足是湿度大，不易久有 干热消毒适于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并使于使用贮存。加温应到160℃， 保持90-120min。 4.滤过消毒适于大多数培养用液。选择孔径为0.22μm的微孔滤膜，过滤除菌效果 较佳 5.消毒剂适于操作者的皮肤、操作表面和台面、桌椅及墙壁等，常用的消毒剂有来 苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸及70%酒精。 三、培养细胞的鉴定 对培养细胞的鉴定有两个目的：一是观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷 冻贮存的样品重新建立新的培养细胞：二是培养条件（如培养液）变化，对培养细胞的影响。 因为培养条件的一致性，对于实验结果的可信性有极为重要的影响。对于培养细胞的鉴定包 括污染鉴定、生存指标及细胞性质（如细胞形态、生长特性、染色体数目及结枸等）。 (一)污染鉴定 细胞培养中常见的污染有真菌、细菌和支原体等，此外有化学物和非同一种细胞的污染。 受到污染的细胞培养可明显地改变生长特性，引起pH变化和生长迟缓。污染常常表现为pH 变化，培养液表面起泡或起膜，培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可 消失。肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢 1.鉴定方法真菌或细菌的污染可用肉眼或低倍光学显微镜观察，支原体仅能用特别 的荧光染料如Ho©chst33258染色后在光学显微镜下，或用扫描电子显微镜观察。由于用肉 眼无法发现支原体的污染，在细胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便和最 可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微镜下观察 2.处理基本的良好消毒技术并不 定能防止污染，还应注意下列方面：消毒步骤如 高压锅和干热消毒柜)的效果：多层流防护罩的消毒效果：经常检查培养器皿：每个工作老 有自己配制的培养用液，处理受污染的培养用具和环境。对于己污染或怀疑污染的培养用具 均可用2.5%高氯酸处理。用抗生素对预防或去除细菌污染较为有效。对支原体污染，消除 方法较多，如抗生素、加温及动物体内接种等，但都较为繁琐，且效果不甚满意，最好的力
时，均在临用前加入 NaHCO3 溶液。常用浓度有 3.7％、5.6％和 7.4%。此外，还有 HEPES 溶液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间保持恒定的 pH 值范围。使用终浓度为 10～15mmol ／L。 染色液：常用的有①苏木精-伊红染色液或称 H.E 染色；②Giemsa 染色液。 固定液：常用的有①中性缓冲福尔马林，相当于 10％的福尔马林；②Bouin 氏固定液； ③醋酸甲醇，临用前配制，结合 Giemsa 染色效果较好；④FAA 固定液，由福尔马林、冰醋 酸及 80％酒精组成，用于盖片单层培养的固定。 (三) 消毒技术 在细胞培养中，消毒是最基本的一项工作，它直接影响实验的结果。消毒措施应在细胞 培养的每个环节严格执行。细胞培养的微生物污染，包括细菌、真菌及病毒，它们主要来源 于：操作者的粗心；操作表面或周围的环境；培养液及培养器皿的灭菌不彻底或存放时间过 久等。 对不同的细胞培养所用物品，可采用不同的消毒灭菌的方法。一般有两类：一是物理灭 菌法，即利用紫外线、干热及微孔过滤等；二是化学灭菌法，即利用化学消毒剂。主要消毒 方面法介绍如下： 1. 紫外线 适于消毒空气、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培养板等， 使用方便，效果较好。应注意其可产生臭氧，影响健康。 2. 高压蒸气消毒 它适于金属器械、胶塞、布类及某些培养液。一般要求 15 磅压力下 20min。或者更简单的，煮沸消毒，其不足是湿度大，不易久存。 3. 干热消毒 适于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用贮存。加温应到 160℃， 保持 90-120min。 4. 滤过消毒 适于大多数培养用液。选择孔径为 0.22μm 的微孔滤膜，过滤除菌效果 较佳。 5. 消毒剂 适于操作者的皮肤、操作表面和台面、桌椅及墙壁等，常用的消毒剂有来 苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸及 70％酒精。 三、培养细胞的鉴定 对培养细胞的鉴定有两个目的：一是观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷 冻贮存的样品重新建立新的培养细胞；二是培养条件(如培养液)变化，对培养细胞的影响。 因为培养条件的一致性，对于实验结果的可信性有极为重要的影响。对于培养细胞的鉴定包 括污染鉴定、生存指标及细胞性质(如细胞形态、生长特性、染色体数目及结构等)。 (一) 污染鉴定 细胞培养中常见的污染有真菌、细菌和支原体等，此外有化学物和非同一种细胞的污染。 受到污染的细胞培养可明显地改变生长特性，引起 pH 变化和生长迟缓。污染常常表现为 pH 变化，培养液表面起泡或起膜，培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可 消失。肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢。 1. 鉴定方法 真菌或细菌的污染可用肉眼或低倍光学显微镜观察，支原体仅能用特别 的荧光染料如 Hoechst 33258 染色后在光学显微镜下，或用扫描电子显微镜观察。由于用肉 眼无法发现支原体的污染，在细胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便和最 可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微镜下观察。 2. 处理 基本的良好消毒技术并不一定能防止污染，还应注意下列方面：消毒步骤(如 高压锅和干热消毒柜)的效果；多层流防护罩的消毒效果；经常检查培养器皿；每个工作者 有自己配制的培养用液，处理受污染的培养用具和环境。对于已污染或怀疑污染的培养用具 均可用 2.5％高氯酸处理。用抗生素对预防或去除细菌污染较为有效。对支原体污染，消除 方法较多，如抗生素、加温及动物体内接种等，但都较为繁琐，且效果不甚满意，最好的办
法是弃去，再重新培养。 ()生存指标 .台盼蓝排斥试验是判定细胞损伤的快速试验，它还可很方便进行细胞计数。具体 方法如下： ①取少量细胞混悬液，加人等量的0.5%台盼蓝溶液。 ②放置15mn后，将混合液滴入血细驹计新池内。 ③显微镜下，细胞显蓝色的为死亡细胞，尤其是核深染，而未染的细胞为存活细胞。统 计出细胞总数后 可计算出细胞存活率。 2.酶福出的检测胞浆衡如乳酸脱氢衡(LD川的漏出检测也与染料排序试验有同样的 灵敏度，同时，可更精确地进行定量，但操作时间较长。 (1)仪器：分光光度计，最好配有温育(37℃)的装置 0.9%NaCL,0.1%TritorX-100和0.1%牛血清白蛋白。 底物3.5 g K2HPO4,0.45 gkH.PO:和31.0mg丙酮酸钠溶于450ml的蒸馏水。配好后， 可贮存于-20℃的冰箱内。 NADH,称42mg,溶于4.5ml的1%NaHCO,临用前配制。 (3)操作步骤：离心，以适当速度使所有细胞沉淀而不引起细胞损伤。例如肝细胞用50 ×2min。取出上清，放人干净试管， 并保持0℃以下各用，加入等量的溶液至细胞沉淀，用 漩涡混合器混合。保持在0℃以下，备用。 取一比色杯，加3ml底物，50μ1的NADH和25-200μ1的样品（取决于培养细胞的种 类)，迅速混合后，在340m处进行比色。整个过程应在37C条件下完成。计算上清或沉淀 (即溶液中细胞)的LDH活性，漏出率表示方法为培养液中LDH活性占总的LDH活性的百 分密 3.其它方法 铬的释放，利用1C+可被活细胞吸收，并还原成1C,留在胞内，而 死亡细胞测释放Cr3*。用~计数器检无细跑上清液中Cr+的量，即可判断培养细胞的 存活情况。还有贴壁效率和ATP含量等指标可鉴定培养细胞的存活情况。 (三)细胞特性鉴定 在连续培养期间，细胞可能发生某些变化，如细胞与原始细胞的差异逐渐加大。但每 细胞株具有 系列细胞特性“正常”的参数， 可供鉴定评价。例如，形态学参数、生长特性 及染色体分析等皆为细胞特性鉴定的指标，其中形态学与生长特性的测定相对容易进行。 1.形态学检查评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查：应在每次传代时用倒 置显微镜进行观察，最好拍照记录细胞的形态。要详细地描述每一细胞系的形态。若因限于 篇幅，不能详述，可掌握两个述语，即“成纤维样”和“上皮样”细胞，即可描述所观察的 细胞。成纤维样细胞系指在单层细胞培养时，细胞的长度要大于其宽度的两倍的细胞，而上 皮样细胞系指呈多角形的细胞。 2.生长特性的检查在培养细胞时，其生长特性的检查较易进行，主要通过测定更换 培养液的时间和传代的时间来完成。虽然不同的细胞其传代时间和更换培养液的时间不同， 但对于每一细胞系应该较为固定，因为主要取决于细胞生长速率。 每个细胞系均有其自己的生长循环周期，这取决于接种进行培养的细胞数目。一般认为， 在培养中的细 是处于 同的生长阶段。进行 分析 应观 单个 细胞 的生长 速率。在 实际工作中，是测定克隆效率或者接种效率。克隆效率是测定由单个细胞生长的克隆。接种 效率是测定植入小量细胞(2-50个/cm)后，等生长至可分辨的小克隆时，经用生理盐水洗 涤，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml/25cm和清水神洗后，计算克隆数
法是弃去，再重新培养。 (二) 生存指标 1. 台盼蓝排斥试验 是判定细胞损伤的快速试验，它还可很方便进行细胞计数。具体 方法如下： ①取少量细胞混悬液，加人等量的 0.5％台盼蓝溶液。 ②放置 1-5min 后，将混合液滴入血细胞计数池内。 ③显微镜下，细胞显蓝色的为死亡细胞，尤其是核深染，而未染的细胞为存活细胞。统 计出细胞总数后，可计算出细胞存活率。 2. 酶漏出的检测 胞浆酶如乳酸脱氢酶(LDH)的漏出检测也与染料排斥试验有同样的 灵敏度，同时，可更精确地进行定量，但操作时间较长。 (1) 仪器：分光光度计，最好配有温育(37℃)的装置。 (2) 试剂： 溶液 0.9％NaCl，0.1％TritorX-100 和 0.1％牛血清白蛋白。 底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4和 31.0mg 丙酮酸钠溶于 450ml 的蒸馏水。配好后， 可贮存于-20℃的冰箱内。 NADH，称 42mg，溶于 4.5ml 的 1％NaHCO3，临用前配制。 (3) 操作步骤：离心，以适当速度使所有细胞沉淀而不引起细胞损伤。例如肝细胞用 50g ×2min。取出上清，放人干净试管，并保持 0℃以下备用，加入等量的溶液至细胞沉淀，用 漩涡混合器混合。保持在 0℃以下，备用。 取一比色杯，加 3ml 底物，50μl 的 NADH 和 25~200μl 的样品(取决于培养细胞的种 类)，迅速混合后，在 340nm 处进行比色。整个过程应在 37℃条件下完成。计算上清或沉淀 (即溶液中细胞)的 LDH 活性，漏出率表示方法为培养液中 LDH 活性占总的 LDH 活性的百 分率。 3. 其它方法 铬的释放，利用 51Cr3+可被活细胞吸收，并还原成 51Cr3+，留在胞内，而 死亡细胞则释放 51Cr3+。用 r-计数器检测无细胞上清液中 51Cr3+的量，即可判断培养细胞的 存活情况。还有贴壁效率和 ATP 含量等指标可鉴定培养细胞的存活情况。 (三) 细胞特性鉴定 在连续培养期间，细胞可能发生某些变化，如细胞与原始细胞的差异逐渐加大。但每一 细胞株具有一系列细胞特性“正常”的参数，可供鉴定评价。例如，形态学参数、生长特性 及染色体分析等皆为细胞特性鉴定的指标，其中形态学与生长特性的测定相对容易进行。 1. 形态学检查 评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查；应在每次传代时用倒 置显微镜进行观察，最好拍照记录细胞的形态。要详细地描述每一细胞系的形态。若因限于 篇幅，不能详述，可掌握两个述语，即“成纤维样”和“上皮样”细胞，即可描述所观察的 细胞。成纤维样细胞系指在单层细胞培养时，细胞的长度要大于其宽度的两倍的细胞，而上 皮样细胞系指呈多角形的细胞。 2. 生长特性的检查 在培养细胞时，其生长特性的检查较易进行，主要通过测定更换 培养液的时间和传代的时间来完成。虽然不同的细胞其传代时间和更换培养液的时间不同， 但对于每一细胞系应该较为固定，因为主要取决于细胞生长速率。 每个细胞系均有其自己的生长循环周期，这取决于接种进行培养的细胞数目。一般认为， 在培养中的细胞，是处于不同的生长阶段。进行生长分析，应观察单个细胞的生长速率。在 实际工作中，是测定克隆效率或者接种效率。克隆效率是测定由单个细胞生长的克隆。接种 效率是测定植入小量细胞(2~50 个／cm2 )后，等生长至可分辨的小克隆时，经用生理盐水洗 涤，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2 )和清水冲洗后，计算克隆数
克隆数目 接种效率箱入细定数×100% 一般认为，传代效率小于30表示生长不正常。此项指标可用于正常细胞生长的监测 贮存细胞的复苏及鉴定每一批血清等 在细胞培养试验中，一般监测指标可采用形态学、生长模式及接种效率即可。 3.其它检查除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目 和结构以及DNA、RNA和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。 七、细胞培养在食品靠理学中应用 利用培养的细胞，可进行多方面的毒理学研究，如表124中所列 表124培养细胞用于毒理学体外实验的实例 用有 代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等 生物转化、毒性代谢产物的形成 遗传毒性，如程序外DNA合成测定 紧殖击性 间的比较毒性 以下重点讨论毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题。 1.细胞类型的选择细胞类型的选择取决于实验的目的。一般性筛选系列化合物的 般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。机理研究多不用细跑系，因为培养的细胞 会逐渐丧失许多功能， 如细胞色素P.450的活性。 细胞培养的优点之 一是可选择来源于人体的组织细胞，可减少试验结果的物种差异。成 纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。常用的细胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。 2.代谢活化细胞经8-24h培养后，细胞色素P450活性将迅速下降。而在CH0细胞 系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。 解决这个问题有两个方法 是加S9,二是与原代肝细胞复合培养。S9需要NADPH 才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有NADPH生成系统（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄 糖-6-磷酸和NADP)。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如V79, 中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。 3.受试物的给予许多受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂 有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在1⅓以下。在试验中可设立适当的有 机溶剂对照和培养液对照 例如，需用S9混合液：有机溶剂的浓度应限制在0.1%，因》 许多有机溶剂可抑制酶的活性。不溶性的受试物如，颗粒和油剂在给子培养液时仍存在问题 般是混悬于培养液或者先溶于溶剂，再加人培养液，但有时会产生不同的毒性结果。例如 黄樟酰和降脂乙醚等油性受试物，假如使用高剂量时将有某些塑料培养皿成分的溶出，则所 现察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致 设立阳性对照组 实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用 经过研究或公认有特定作用的化学物。 例如在代谢活化研究中常选择环磷酰胺为阳性对照 物，在细胞毒性筛检时可选二甲基环己基烃乙基戊二酰亚胺和二硝基苯酚为阳性对照物。 5.毒性指标的选择依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列 指标在毒理学中经常采用 ()1Co:即经3天培养后， 引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长过
接种效率= 100% 植入细胞数目 克隆数目 一般认为，传代效率小于 30 表示生长不正常。此项指标可用于正常细胞生长的监测， 贮存细胞的复苏及鉴定每一批血清等。 在细胞培养试验中，一般监测指标可采用形态学、生长模式及接种效率即可。 3. 其它检查 除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目 和结构以及 DNA、RNA 和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。 七、细胞培养在食品毒理学中应用 利用培养的细胞，可进行多方面的毒理学研究，如表 12-4 中所列。 表 12-4 培养细胞用于毒理学体外实验的实例 一般毒性：主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性：利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等： 毒作用机理 生物转化、毒性代谢产物的形成 遗传毒性，如程序外 DNA 合成测定 繁殖毒性 联合毒性 不同物种间的比较毒性 光敏毒性 以下重点讨论毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题。 1. 细胞类型的选择 细胞类型的选择取决于实验的目的。一般性筛选系列化合物的一 般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。机理研究多不用细胞系，因为培养的细胞 会逐渐丧失许多功能，如细胞色素 P-450 的活性。 细胞培养的优点之一是可选择来源于人体的组织细胞，可减少试验结果的物种差异。成 纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。常用的细胞系有 CHO、V79、Hela、BHR 及 L929 等。 2. 代谢活化 细胞经 8-24h 培养后，细胞色素 P-450 活性将迅速下降。而在 CHO 细胞 系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。 解决这个问题有两个方法，一是加 S9，二是与原代肝细胞复合培养。S9 需要 NADPH 才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有 NADPH 生成系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄 糖-6-磷酸和 NADP)。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如 V79、 中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。 3. 受试物的给予许多 受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂 有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在 1％以下。在试验中可设立适当的有 机溶剂对照和培养液对照。例如，需用 S9 混合液；有机溶剂的浓度应限制在 0.1％，因为 许多有机溶剂可抑制酶的活性。不溶性的受试物如，颗粒和油剂在给予培养液时仍存在问题。 一般是混悬于培养液或者先溶于溶剂，再加人培养液，但有时会产生不同的毒性结果。例如， 黄樟醚和降脂乙醚等油性受试物，假如使用高剂量时将有某些塑料培养皿成分的溶出，则所 观察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 设立阳性对照组 实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用 经过研究或公认有特定作用的化学物。例如在代谢活化研究中常选择环磷酰胺为阳性对照 物，在细胞毒性筛检时可选二甲基环己基烃乙基戊二酰亚胺和二硝基苯酚为阳性对照物。 5. 毒性指标的选择 依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列 指标在毒理学中经常采用： (1) IC50：即经 3 天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长速