第十章天然药物化学实验 第十章天然药物化学实验 第一节天然药物化学实验引言 一、天然药物化学实验一般要求 天然药物化学是运用现代科学理论与技术研究天然药物中化学成分的一门学 科，是药学、药剂、中药学等相关专业本科学生必修的专业课，也是国家执业药师（中 药学)资格考试必考课程。本课程是在学生完成有机化学、分析化学、有机化合物波 谱学、中药学、生药学、药理学等课程学习的基础上，重点讲授天然药物中化学成 分的化学结构、理化性质、提取分离、结构鉴定、天然药物新药开发等方面的基本 原理与实验技能，培养学生具有从事天然药物方面的研究、开发和生产能力，为我 国药学事业的发展输送人才。 天然药物化学实验是天然药物化学课的重要组成部分。学习的主要目的是通过 实验操作检验和巩固课堂上所学的理论知识，使学生对理论知识的理解更加深入， 握得更加牢固：通过实验训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题、解决问 题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练：同时使学生养成严 谨的科学态度和良好的科学作风。为使学生更好地了解专业英语，轻松地阅读专业 英文文献，本版实验指导编辑了2个中英文对照实验题目。 实验教学的重点是加强学生基本操作技能的训练，学生在学习天然药物化学实 验后，应基本掌握以下技能： (一)提取分离 1.掌握浸渍法、渗漉法、回流提取法、索氏提取法、重结品法等提取或纯化技 术的原理和操作。 2.掌握纸色谱、薄层色谱、硅胶柱色谱、离子交换柱色谱的原理和操作。 (二)结构鉴定 1.掌握各类化学成分的一般定性反应在成分鉴定中的应用。 2。掌握紫外光谱在黄酮类结构测定中的基本应用
第十章 天然药物化学实验 1 第十章 天然药物化学实验 第一节 天然药物化学实验引言 一、天然药物化学实验一般要求 天然药物化学是运用现代科学理论与技术研究天然药物中化学成分的一门学 科，是药学、药剂、中药学等相关专业本科学生必修的专业课，也是国家执业药师(中 药学)资格考试必考课程。本课程是在学生完成有机化学、分析化学、有机化合物波 谱学、中药学、生药学、药理学等课程学习的基础上，重点讲授天然药物中化学成 分的化学结构、理化性质、提取分离、结构鉴定、天然药物新药开发等方面的基本 原理与实验技能，培养学生具有从事天然药物方面的研究、开发和生产能力，为我 国药学事业的发展输送人才。 天然药物化学实验是天然药物化学课的重要组成部分。学习的主要目的是通过 实验操作检验和巩固课堂上所学的理论知识，使学生对理论知识的理解更加深入， 掌握得更加牢固；通过实验训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题、解决问 题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练；同时使学生养成严 谨的科学态度和良好的科学作风。为使学生更好地了解专业英语，轻松地阅读专业 英文文献，本版实验指导编辑了 2 个中英文对照实验题目。 实验教学的重点是加强学生基本操作技能的训练，学生在学习天然药物化学实 验后，应基本掌握以下技能： (一)提取分离 1. 掌握浸渍法、渗漉法、回流提取法、索氏提取法、重结晶法等提取或纯化技 术的原理和操作。 2. 掌握纸色谱、薄层色谱、硅胶柱色谱、离子交换柱色谱的原理和操作。 (二)结构鉴定 1. 掌握各类化学成分的一般定性反应在成分鉴定中的应用。 2. 掌握紫外光谱在黄酮类结构测定中的基本应用
第十章天然药物化学实验 2 二、学生实验成绩评定 学生实验总成绩由实验指导教师根据以下七项要求综合评定： (一)学生课前预习情况(5%)： (二)实验过程中的合理安排(5%)： (三)实验中的科学素票(10%)： (四)仪器的操作规范与熟练程度(30%)： (五)实验记录、结果及实验报告(30%)： (六)实验理论笔试(10%)： (七)实验专项技能/技术考核(10%) 第二节天然药物化学常用实验技能 一、圆形（径向）纸色谱检识技术(Paper chromatography) 0仁燥作技术及程序。010000100000010口 1,准备仅器及试剂：培养血一对直径相等色谱滤纸、毛细管、相关试剂等。 取斯名食 直径约为1.5~2.0cm的圆，做为点样起始线。在此圆的中心打一小孔，将一个长方 形的滤纸条搓成一个滤纸芯，插在色谱滤纸的小孔中，纸芯与色谱滤纸垂直，纸芯 的高度要比培养皿上下合盖后的内部高度稍低。 3.点样：用毛细管将样品及对照品溶液点在色谱滤纸上所画的圆形起始线上， 做好标记，晾（吹）干。 4.选择及配制展开剂。 5.展开：将展开剂适量倒入培养皿中，上下盖好，平衡放置，保持5分钟左右， 使其内部达液~气饱和。然后将色谱滤纸小心“扣盖”在培养皿的下皿中，色谱纸保持 水平，纸芯保持直立并插入展开剂中，扣好培养皿上盖。展开剂将沿小纸芯向上浸 湿，到达色谱滤纸后以一个圆形的湿斑慢慢向四周扩展。当展开剂浸湿色谱纸一定 距离（一般接近培养皿边沿）后即可结束展开。将色谱滤纸取出，做好前沿标记，自 然晾干或吹干（图10-1）
第十章 天然药物化学实验 2 二、学生实验成绩评定 学生实验总成绩由实验指导教师根据以下七项要求综合评定： (一)学生课前预习情况(5%)； (二)实验过程中的合理安排(5%)； (三)实验中的科学素养(10%)； (四)仪器的操作规范与熟练程度(30%)； (五)实验记录、结果及实验报告(30%)； (六)实验理论笔试(10%)； (七)实验专项技能/技术考核(10%)。 第二节 天然药物化学常用实验技能 一、圆形(径向)纸色谱检识技术(Paper chromatography) (一)操作技术及程序 1. 准备仪器及试剂：培养皿一对(直径相等)、色谱滤纸、毛细管、相关试剂等。 2. 准备色谱滤纸：取直径 12.5 cm 的圆形色谱滤纸，将滤纸划分出数个区间(根 据所点样品的数目划分区间，滤纸不得有折痕或划痕)，在滤纸中心处用铅笔轻轻画 直径约为 1.5~2.0 cm 的圆，做为点样起始线。在此圆的中心打一小孔，将一个长方 形的滤纸条搓成一个滤纸芯，插在色谱滤纸的小孔中，纸芯与色谱滤纸垂直，纸芯 的高度要比培养皿上下合盖后的内部高度稍低。 3. 点样：用毛细管将样品及对照品溶液点在色谱滤纸上所画的圆形起始线上， 做好标记，晾(吹)干。 4. 选择及配制展开剂。 5. 展开：将展开剂适量倒入培养皿中，上下盖好，平衡放置，保持 5 分钟左右， 使其内部达液~气饱和。然后将色谱滤纸小心“扣盖”在培养皿的下皿中，色谱纸保持 水平，纸芯保持直立并插入展开剂中，扣好培养皿上盖。展开剂将沿小纸芯向上浸 湿，到达色谱滤纸后以一个圆形的湿斑慢慢向四周扩展。当展开剂浸湿色谱纸一定 距离(一般接近培养皿边沿)后即可结束展开。将色谱滤纸取出，做好前沿标记，自 然晾干或吹干(图 10-1)
第十章天然药物化学实验 3 一色谱滤纸 起始线 样品样点 滤纸 图10-1径向纸色谱装置示意图 6.显色：根据所测样品性质选择合适的显色方法，观察色斑的位置。 7.观察实验结果：确定出化合物斑点位置后，用尺子测量距离，计算比移值( 或与标准品对照。 (二)注意事项 1.色谱纸小心取放，不得折叠、污染。 2.选择适宜展开剂，否则样品展开效果差。 3.点样量要合适，浓度小则展开后观察不清楚，浓度太大则有拖尾现象。 二、硅胶薄层色谱检识技术(Thin Layer e●●。。。●Chromatography,TLC)●●●●。●●●e 一燥作技术及程序。。 1.准备仪器及试剂：色谱缸、TLC专用玻璃板(5cm×20cm)、研钵、薄层用 硅胶、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液、其他相关试剂等。 2.制板 (1)硅胶G板：称取2.5~3g硅胶G放入研钵中，加入约7~9ml0.5%的CMC 水溶液（硅胶：CMC=1:2~3)混合成均匀的粘稠状溶液，再将其倒在TLC玻璃板上 并涂布均匀，然后轻轻颠荡使硅胶均匀地分布，形成均匀厚度的硅胶层。水平放置， 自然晾干。 (2)荧光薄板：称取硅胶GF2s42.5~3g,同硅胶G法制备。 (3)AgNO,-硅胶G板：在硅胶G中加入10%硝酸银水溶液调成均匀的糊状溶液， 其余同硅胶G法制备。 3.活化：将自然晾干的硅胶板放于烤箱中，在105110℃烘烤0.5、10小时 拿出自然降温并保存在干燥器中备用。 4.点样：在距硅胶玻璃板下端1.5~2cm处用铅笔轻轻划一直线，勿破坏硅胶 平面，作为点样起始线。分别用毛细管将样品及对照品溶液点在起始线上，晾（吹） 干并做好标记。样品点的直径应在2~3mm以内，样品点之间的间隔应不少于1cm。 5.选择及配制展开剂
第十章 天然药物化学实验 3 展开剂 样品样点 起始线 滤纸捻 色谱滤纸 培养皿上盖 培养皿下盖 图 10-1 径向纸色谱装置示意图 6. 显色：根据所测样品性质选择合适的显色方法，观察色斑的位置。 7. 观察实验结果：确定出化合物斑点位置后，用尺子测量距离，计算比移值(Rf) 或与标准品对照。 (二)注意事项 1. 色谱纸小心取放，不得折叠、污染。 2. 选择适宜展开剂，否则样品展开效果差。 3. 点样量要合适，浓度小则展开后观察不清楚，浓度太大则有拖尾现象。 二、硅胶薄层色谱检识技术(Thin Layer Chromatography，TLC) (一)操作技术及程序 1. 准备仪器及试剂：色谱缸、TLC 专用玻璃板(5 cm × 20 cm)、研钵、薄层用 硅胶、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液、其他相关试剂等。 2. 制板 (1) 硅胶 G 板：称取 2.5~3 g 硅胶 G 放入研钵中，加入约 7 ~ 9 ml 0.5%的 CMC 水溶液(硅胶 : CMC =1 : 2~3)混合成均匀的粘稠状溶液，再将其倒在 TLC 玻璃板上 并涂布均匀，然后轻轻颠荡使硅胶均匀地分布，形成均匀厚度的硅胶层。水平放置， 自然晾干。 (2) 荧光薄板：称取硅胶 GF254 2.5~3 g，同硅胶 G 法制备。 (3) AgNO3-硅胶 G 板：在硅胶 G 中加入 10％硝酸银水溶液调成均匀的糊状溶液， 其余同硅胶 G 法制备。 3. 活化：将自然晾干的硅胶板放于烤箱中，在 105~110 ℃烘烤 0.5~1.0 小时， 拿出自然降温并保存在干燥器中备用。 4. 点样：在距硅胶玻璃板下端 1.5~2 cm 处用铅笔轻轻划一直线，勿破坏硅胶 平面，作为点样起始线。分别用毛细管将样品及对照品溶液点在起始线上，晾(吹) 干并做好标记。样品点的直径应在 2~3 mm 以内，样品点之间的间隔应不少于 1 cm。 5. 选择及配制展开剂
第十章天然药物化学实验 4 6.展开：先将展开剂适量置于色谱缸中，再将薄层板放于色谱缸中（不得浸入 展开剂中)，盖好上盖，保持15分钟左右，使其内部达液-气饱和。然后将硅胶板下 端小心慢慢地浸入到展开剂中，勿使展开剂浸没点样起始线，加盖使色谱缸密闭。 此时将会观察到展开剂沿硅胶板逐渐向上浸湿（即展开），展开距离一般为12cm以 上。将硅胶板取出，在前沿处作出标记，自然晾干或吹干（图10-2） ,色谱杠、 展开起始阀 一“展开剂 色谐缸正面 色谱缸侧面 TLC板 图10-2TLC色诺操作示意图 7.显色：根据样品性质选择合适的显色方法进行样品的显色观察。 8。计算比移值R及与标准品对照。 (二)注意事项 。1.硅胶板小心取放，不要受污染、刮蹭。。。。。。。。。。。。。 2.样品的点样量要合适，如果浓度小则展开后观察不清楚：如果浓度太大或 样直径过大可能有拖尾现象。如果样品溶液的浓度较低，可用毛细管反复在点样处 3.展开剂一定要选择合适，否则样品展开分离效果差。 4.荧光硅胶（硅胶-GF254)与硅胶-G的使用方法相同，但不用显色剂，可在紫外 灯(254nm)下观察样品展开情况 三、硅胶柱色谱分离技术(Column Chromatography,CC) (一)操作技术及程序 1.准备仪器及试剂：玻璃色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。 2.装硅胶色谱柱 (1)干法装柱：打开色谱柱下端活塞，放入适当干燥脱脂棉垫入底部，取200-300 目的柱色谱用硅胶适量加入到色谱柱中，加完后不断轻轻敲打色谱柱壁，使硅胶紧 密均实。 (2)湿法装柱：在色谐柱底部垫入适当干燥脱脂棉，打开色谱柱下端活塞。取 200~300目的柱色谱用硅胶适量，置于烧杯中，加入适量的有机溶剂，搅拌使硅胶 完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。注意加硅胶时要打开活塞，让硅
第十章 天然药物化学实验 4 6. 展开：先将展开剂适量置于色谱缸中，再将薄层板放于色谱缸中(不得浸入 展开剂中)，盖好上盖，保持 15 分钟左右，使其内部达液-气饱和。然后将硅胶板下 端小心慢慢地浸入到展开剂中，勿使展开剂浸没点样起始线，加盖使色谱缸密闭。 此时将会观察到展开剂沿硅胶板逐渐向上浸湿(即展开)，展开距离一般为 12 cm 以 上。将硅胶板取出，在前沿处作出标记，自然晾干或吹干(图 10-2)。 o 色谱板 展开剂 色谱缸 o A B a b h 展开剂前沿 展开起始线 色谱缸正面 色谱缸侧面 TLC板 图 10-2 TLC 色谱操作示意图 7. 显色：根据样品性质选择合适的显色方法进行样品的显色观察。 8. 计算比移值 Rf 及与标准品对照。 (二)注意事项 1. 硅胶板小心取放，不要受污染、刮蹭。 2. 样品的点样量要合适，如果浓度小则展开后观察不清楚；如果浓度太大或点 样直径过大可能有拖尾现象。如果样品溶液的浓度较低，可用毛细管反复在点样处 多点几次。 3. 展开剂一定要选择合适，否则样品展开分离效果差。. 4. 荧光硅胶(硅胶-GF254)与硅胶-G 的使用方法相同，但不用显色剂，可在紫外 灯(254 nm)下观察样品展开情况。 三、硅胶柱色谱分离技术(Column Chromatography, CC) (一)操作技术及程序 1. 准备仪器及试剂：玻璃色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。 2. 装硅胶色谱柱 (1) 干法装柱：打开色谱柱下端活塞，放入适当干燥脱脂棉垫入底部。取 200~300 目的柱色谱用硅胶适量加入到色谱柱中，加完后不断轻轻敲打色谱柱壁，使硅胶紧 密均实。 (2) 湿法装柱：在色谱柱底部垫入适当干燥脱脂棉，打开色谱柱下端活塞。取 200~300 目的柱色谱用硅胶适量，置于烧杯中，加入适量的有机溶剂，搅拌使硅胶 完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。注意加硅胶时要打开活塞，让硅
第十章天然药物化学实验 5 胶自然下沉，液面保持在硅胶之上，硅胶柱中不得有气泡。加样前，液面高度要保 持在10-20mm左右。 3.加入待分离样品 (1)方法1：一般将样品溶液溶于少量初始的洗脱剂中，制成样品溶液，轻轻注 入已准各好的硅胶柱上面，勿使柱面受到扰动，否则影响色谱效果 (2)方法山：如样品不溶于初始的洗脱剂，则将样品溶于挥发性的溶剂（如甲醇、 丙酮等)中，然后取少量吸附剂与其拌匀，除尽溶剂，再将含有样品的吸附剂均匀地 加入到色谱柱的顶端，再覆盖上少量保护硅胶或脱脂棉、小玻璃球将其压住，以防 洗脱时神乱顶部的拌样硅胶。 4.选择及配制洗脱剂。 5.洗脱与接收：将洗脱剂置于色谱柱最上面安装好的分液漏斗中。打开色谱柱 下端活塞，然后打开分液漏斗活塞滴加洗脱剂开始洗脱并接收，洗脱时要始终保持 洗脱剂液面在样品层之上，洗脱剂流速保持在1~2滴/秒左右。等份收集洗脱液， 一般先选用洗脱能力弱的溶剂，然后逐步增加洗脱能力（图103）。 6.配合TLC或其他方法即时检查洗脱液（即：接收液）。 滴液漏斗 e●000●000●0●0。●Z ●●●●●●少量硅胶或脂棉一 玻璃色谐柱 一色谱硅胶 脱脂棉 洗脱液 图10-3硅胶色谱分离装置示意图 (二)注意事项 1.硅胶吸附拌样的比例约为：样品：硅胶=1：1或1：2。 2.吸附剂硅胶的使用量比例约为：样品：硅胶=1：30-60或1：100（难分离物）。 3.洗脱剂的极性选择要合适，否则得不到很好的分离。 4.洗脱的速度要合适，一般保持在2~5ml/min 四、离子交换柱色谱分离技术(Ion Exchange
第十章 天然药物化学实验 5 胶自然下沉，液面保持在硅胶之上，硅胶柱中不得有气泡。加样前，液面高度要保 持在 10~20 mm 左右。 3. 加入待分离样品 (1) 方法 I：一般将样品溶液溶于少量初始的洗脱剂中，制成样品溶液，轻轻注 入已准备好的硅胶柱上面，勿使柱面受到扰动，否则影响色谱效果。 (2) 方法 II：如样品不溶于初始的洗脱剂，则将样品溶于挥发性的溶剂(如甲醇、 丙酮等)中，然后取少量吸附剂与其拌匀，除尽溶剂，再将含有样品的吸附剂均匀地 加入到色谱柱的顶端，再覆盖上少量保护硅胶或脱脂棉、小玻璃球将其压住，以防 洗脱时冲乱顶部的拌样硅胶。 4. 选择及配制洗脱剂。 5. 洗脱与接收：将洗脱剂置于色谱柱最上面安装好的分液漏斗中。打开色谱柱 下端活塞，然后打开分液漏斗活塞滴加洗脱剂开始洗脱并接收，洗脱时要始终保持 洗脱剂液面在样品层之上，洗脱剂流速保持在 1～2 滴/秒左右。等份收集洗脱液， 一般先选用洗脱能力弱的溶剂，然后逐步增加洗脱能力(图 10-3)。 6. 配合 TLC 或其他方法即时检查洗脱液(即：接收液)。 色谱硅胶 样品 洗脱剂液面 洗脱剂 少量硅胶或脱脂棉 脱脂棉 洗脱液 玻璃色谱柱 滴液漏斗 接收瓶 图 10-3 硅胶色谱分离装置示意图 (二)注意事项 1. 硅胶吸附拌样的比例约为：样品:硅胶=1:1 或 1:2。 2. 吸附剂硅胶的使用量比例约为：样品:硅胶=1:30~60 或 1:100(难分离物)。 3. 洗脱剂的极性选择要合适，否则得不到很好的分离。 4. 洗脱的速度要合适，一般保持在 2~5 ml/min。 四、离子交换柱色谱分离技术(Ion Exchange