／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按 1.0～ 1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为 15～ 20g 的标准蛋白样品溶液，放置在 0.5mL 的离心管中，加入 15—20l 的样品处理液。 在 100℃水浴中处理 2min，冷却至室温后备用。 吸取未知分子量的蛋白质样品 20l，按照标准蛋白的处理方法进行处理。 4．加样 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法 用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶 框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电 泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿 3mm 处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。 加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量 注射器依次在各样品槽内加样，各加 10～15l(含蛋白质 10～15g)，稀溶液可加 20～30l (还要根据胶的厚度灵活掌握)。 5．电泳 加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制 在 15～20mA，大约 15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到 30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿 1～2cm 处即停止 电泳，约 1-2 小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。 6．染色、脱色 电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻 轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入 铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用 0.25％的考马斯亮蓝染液，染色 2～4h， 必要时可过夜。 弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经 常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。 7．结果处理 1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔 的距离)，测量指示染料迁移的距离。 2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm) 相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm) 3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。 4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查 得该蛋白质的分子量。 五、思考题 1． 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？ 2． 电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？ 3． 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？
／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按 1.0～ 1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为 15～ 20g 的标准蛋白样品溶液，放置在 0.5mL 的离心管中，加入 15—20l 的样品处理液。 在 100℃水浴中处理 2min，冷却至室温后备用。 吸取未知分子量的蛋白质样品 20l，按照标准蛋白的处理方法进行处理。 4．加样 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法 用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶 框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电 泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿 3mm 处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。 加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量 注射器依次在各样品槽内加样，各加 10～15l(含蛋白质 10～15g)，稀溶液可加 20～30l (还要根据胶的厚度灵活掌握)。 5．电泳 加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制 在 15～20mA，大约 15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到 30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿 1～2cm 处即停止 电泳，约 1-2 小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。 6．染色、脱色 电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻 轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入 铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用 0.25％的考马斯亮蓝染液，染色 2～4h， 必要时可过夜。 弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经 常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。 7．结果处理 1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔 的距离)，测量指示染料迁移的距离。 2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm) 相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm) 3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。 4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查 得该蛋白质的分子量。 五、思考题 1． 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？ 2． 电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？ 3． 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？
4． 上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？ 5． 贮液配制及贮存应注意什么？ 6．过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？ 实验三：马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验 一、实验目的 1． 学习从组织细胞中制备酶的方法。 2． 掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用的影响。 二、实验原理 多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适 pH 值为 6～7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻 苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的 颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于 该酶作用的结果。 多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构 相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。 酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响，如温度、pH、底物种类、底物浓度、 酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。 三、实验器材 1．匀浆机 2．小刀，纱布，漏斗，其它玻璃器皿 3．离心机 4．冰箱
4． 上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？ 5． 贮液配制及贮存应注意什么？ 6．过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？ 实验三：马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验 一、实验目的 1． 学习从组织细胞中制备酶的方法。 2． 掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用的影响。 二、实验原理 多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适 pH 值为 6～7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻 苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的 颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于 该酶作用的结果。 多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构 相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。 酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响，如温度、pH、底物种类、底物浓度、 酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。 三、实验器材 1．匀浆机 2．小刀，纱布，漏斗，其它玻璃器皿 3．离心机 4．冰箱
5．恒温水浴 四、材料与试剂 1．马铃薯 2．0.1mol/L 的 NaF 溶液: 将 4.2g 氟化钠溶于 1000mL 水中。 3．0.01mol/L 的邻苯二酚溶液:将 1.1g 邻苯二酚溶解于 1000mL 水中,用稀 NaOH 调节溶液的 pH 值为 6.0,防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮 存于棕色瓶中。 4．pH6.8 的磷酸盐缓冲液 5. 5%三氯乙酸溶液 6. 硫脲 7. 0.01mol/L 的间苯二酚溶液:将 0.11g 间苯二酚溶解于 100mL 水中。 8．0.01mol/L 的对苯二酚溶液:将 0.11g 对苯二酚溶解于 100mL 水中。 9．固体硫酸铵 10．0．8％HCl：19.2mL 浓 HCl 加水稀释到 1000mL。 11．0.2%和 0.3%（V/V）的乳酸溶液。 12. 0.5%的碳酸钠溶液 13．0.01％的碳酸钠溶液 五、操作方法 1．多酚氧化酶的制备 每三个小组一起，称取 150g 马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加 入 150mLNaF 溶液，匀浆后用四层纱布过滤。 各组分别量取 50mL 滤液置离心管中，于 3500 转/min 离心 5～10min，取上清夜，加入 固体硫酸铵 16g，溶解，于 4℃放置 30min，于 3500 转/min 离心 15min，倒掉上清液，沉淀 用 15mL pH6.8 的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗酶液，含有马铃薯多酚氧化酶。 2．多酚氧化酶的催化作用 按表 1 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 1 多酚氧化酶的催化作用 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后 37℃保温 5～10min，观察颜色变化 1 15 滴 15 滴 － 2 15 滴 － 15 滴 3 － 15 滴 15 滴 3． 多酚氧化酶的化学性质 按表 2 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 2 多酚氧化酶的化学性质 试管号 酶液 5％三氯乙酸 硫脲 振荡混匀后分别加入邻苯二酚 15 滴，于 37℃保 温 10min，观察颜色变化 1 15 滴 － －
5．恒温水浴 四、材料与试剂 1．马铃薯 2．0.1mol/L 的 NaF 溶液: 将 4.2g 氟化钠溶于 1000mL 水中。 3．0.01mol/L 的邻苯二酚溶液:将 1.1g 邻苯二酚溶解于 1000mL 水中,用稀 NaOH 调节溶液的 pH 值为 6.0,防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮 存于棕色瓶中。 4．pH6.8 的磷酸盐缓冲液 5. 5%三氯乙酸溶液 6. 硫脲 7. 0.01mol/L 的间苯二酚溶液:将 0.11g 间苯二酚溶解于 100mL 水中。 8．0.01mol/L 的对苯二酚溶液:将 0.11g 对苯二酚溶解于 100mL 水中。 9．固体硫酸铵 10．0．8％HCl：19.2mL 浓 HCl 加水稀释到 1000mL。 11．0.2%和 0.3%（V/V）的乳酸溶液。 12. 0.5%的碳酸钠溶液 13．0.01％的碳酸钠溶液 五、操作方法 1．多酚氧化酶的制备 每三个小组一起，称取 150g 马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加 入 150mLNaF 溶液，匀浆后用四层纱布过滤。 各组分别量取 50mL 滤液置离心管中，于 3500 转/min 离心 5～10min，取上清夜，加入 固体硫酸铵 16g，溶解，于 4℃放置 30min，于 3500 转/min 离心 15min，倒掉上清液，沉淀 用 15mL pH6.8 的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗酶液，含有马铃薯多酚氧化酶。 2．多酚氧化酶的催化作用 按表 1 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 1 多酚氧化酶的催化作用 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后 37℃保温 5～10min，观察颜色变化 1 15 滴 15 滴 － 2 15 滴 － 15 滴 3 － 15 滴 15 滴 3． 多酚氧化酶的化学性质 按表 2 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 2 多酚氧化酶的化学性质 试管号 酶液 5％三氯乙酸 硫脲 振荡混匀后分别加入邻苯二酚 15 滴，于 37℃保 温 10min，观察颜色变化 1 15 滴 － －
2 15 滴 15 滴 － 3 15 滴 － 少许 4．底物专一性 按表 3 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 3 多酚氧化酶的底物专一性 试管号 酶液 邻苯二酚 间苯二酚 对苯二酚 混匀后 37℃保温 5～10min，观察颜 色变化 1 15 滴 15 滴 － － 2 15 滴 － 15 滴 － 3 15 滴 － － 15 滴 5．底物浓度的影响 按表 4 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 4 底物浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后 37℃保温 1min，观察颜色变化 1 5 滴 1 滴 39 滴 2 5 滴 10 滴 30 滴 3 5 滴 40 滴 － 6．酶浓度的影响 按表 5 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 5 酶浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后 37℃保温 2min，观察颜色变化 1 15 滴 15 滴 － 2 1 滴 15 滴 14 滴 7． 氢离子浓度的影响 按表 6 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 管号 1 2 3 4 5 0.8% HCl 40 滴 - - - - 0.3% 乳酸 - 40 滴 - - - 0.2% 乳酸 - - 40 滴 - - 0.01%碳酸钠 - - - 40 滴 - 0.5%碳酸钠 - - - - 40 滴 邻苯二酚 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 酶液 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 混合后 pH 值 1 3 5 7 9 37℃保温 5min，观察颜
2 15 滴 15 滴 － 3 15 滴 － 少许 4．底物专一性 按表 3 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 3 多酚氧化酶的底物专一性 试管号 酶液 邻苯二酚 间苯二酚 对苯二酚 混匀后 37℃保温 5～10min，观察颜 色变化 1 15 滴 15 滴 － － 2 15 滴 － 15 滴 － 3 15 滴 － － 15 滴 5．底物浓度的影响 按表 4 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 4 底物浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后 37℃保温 1min，观察颜色变化 1 5 滴 1 滴 39 滴 2 5 滴 10 滴 30 滴 3 5 滴 40 滴 － 6．酶浓度的影响 按表 5 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 5 酶浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后 37℃保温 2min，观察颜色变化 1 15 滴 15 滴 － 2 1 滴 15 滴 14 滴 7． 氢离子浓度的影响 按表 6 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 管号 1 2 3 4 5 0.8% HCl 40 滴 - - - - 0.3% 乳酸 - 40 滴 - - - 0.2% 乳酸 - - 40 滴 - - 0.01%碳酸钠 - - - 40 滴 - 0.5%碳酸钠 - - - - 40 滴 邻苯二酚 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 酶液 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 7 滴 混合后 pH 值 1 3 5 7 9 37℃保温 5min，观察颜
色变化,确定 最适 pH 值 六、思考题 1．在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？ 2．在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用？ 3．该多酚氧化酶的最适 pH 值是多少？为什么？ 4．通过实验可知哪些因素会影响酶的催化活力？ 实验四：碱性蛋白酶活力的测定（福林—酚试剂法） 一、实验目的 ①学习测定蛋白酶活力的方法。 ②掌握分光光度计的原理和使用方法。 ③学习绘制标淮曲线的方法。 二、实验原理 福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸 中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林 —酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 三、实验器材 ①分光光度计 ②恒温水浴锅 ②冷凝器 四、材料与试剂 ①市售的碱性蛋白酶制剂。 ②0.4mo/L 碳酸钠：42.4gNa2CO3 用蒸馏水溶解．定容到 l000mL。 ③4mo1/L 三氯醋酸：65.6g 三氯醋酸用蒸馏水溶解，定容到 1000 mL。 ④2%酪蛋白：2.0g 酪蛋白加 40mL 蒸馏水，加 3—5 滴浓氨水，于沸水浴上溶解。 用 pH11 的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液定容到 1000mL。 ⑤pH11 的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液：0.1mol/LNaOH 与 0.05mol/LNa2B4O7 等体积混合。 ⑥福林—酚试剂：50g 钨酸钠(Na2W04·2H20)，12.5g 铂酸钠(Na2Mo04·2H20)， 350mL 水，25mL 85％磷酸，50mL 浓盐酸放入 1000mL 圆底烧瓶中，文火回流(保持微沸)10 h，撤下冷凝器，加 150g 硫酸铿(Li2O4)，25mL 水，混匀加溴水约 5mL 脱色。直至金黄色 为止，再微沸 15min，驱除残溴，冷却，用 4—5 号耐酸细菌漏斗过滤，定容到 500mL，盛 于洗干净干燥的棕色瓶中，使用时以 1：2 稀释。 五、操作方法 (1)样品处理
色变化,确定 最适 pH 值 六、思考题 1．在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？ 2．在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用？ 3．该多酚氧化酶的最适 pH 值是多少？为什么？ 4．通过实验可知哪些因素会影响酶的催化活力？ 实验四：碱性蛋白酶活力的测定（福林—酚试剂法） 一、实验目的 ①学习测定蛋白酶活力的方法。 ②掌握分光光度计的原理和使用方法。 ③学习绘制标淮曲线的方法。 二、实验原理 福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸 中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林 —酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 三、实验器材 ①分光光度计 ②恒温水浴锅 ②冷凝器 四、材料与试剂 ①市售的碱性蛋白酶制剂。 ②0.4mo/L 碳酸钠：42.4gNa2CO3 用蒸馏水溶解．定容到 l000mL。 ③4mo1/L 三氯醋酸：65.6g 三氯醋酸用蒸馏水溶解，定容到 1000 mL。 ④2%酪蛋白：2.0g 酪蛋白加 40mL 蒸馏水，加 3—5 滴浓氨水，于沸水浴上溶解。 用 pH11 的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液定容到 1000mL。 ⑤pH11 的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液：0.1mol/LNaOH 与 0.05mol/LNa2B4O7 等体积混合。 ⑥福林—酚试剂：50g 钨酸钠(Na2W04·2H20)，12.5g 铂酸钠(Na2Mo04·2H20)， 350mL 水，25mL 85％磷酸，50mL 浓盐酸放入 1000mL 圆底烧瓶中，文火回流(保持微沸)10 h，撤下冷凝器，加 150g 硫酸铿(Li2O4)，25mL 水，混匀加溴水约 5mL 脱色。直至金黄色 为止，再微沸 15min，驱除残溴，冷却，用 4—5 号耐酸细菌漏斗过滤，定容到 500mL，盛 于洗干净干燥的棕色瓶中，使用时以 1：2 稀释。 五、操作方法 (1)样品处理