一根玻璃管使用时应注意： (1) 经常检查电极内的 4mol/L KCl 溶液的液面, 如液面过低则应补充 4mol/L KCl 溶液。 (2) 玻璃泡极易破碎, 使用时必须极为小心。 (3) 复合电极长期不用, 可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中, 平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液 中, 使用时取出, 用洗并冲洗玻璃泡部分, 然后用吸水纸吸干余水, 将电极浸入待测溶液中 , 稍加搅拌, 读数时电极应静止不动, 以免数字跳动不稳定。 (4) 使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 (5) 使用前要用标准缓冲液校正电极, 其数据见书后附录, 常用的 3 种标准缓冲液 pH 值 4.00 、 6.88 和 9.23(20 ℃ ), 精度为± 0.002pH 单位。校正时先将电极放入 6.88 的标准 缓冲液中, 用 pH 计上的 " 标准 " 旋钮校正 pH 读数, 然后取出电极洗净, 再放入 pH 值为 4.00 或 9.23 的标准缓冲液中, 用 " 斜率 " 旋钮校正 pH 读数, 如此反复多次, 直 至二 点校正正确, 再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 (6) 电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的 pH 值时, 玻璃泡表面会覆 盖一层 蛋白质膜, 不易洗净而干扰测定, 此时可用 0.1mol/L HCl 的 lInurnl 胃蛋白酶溶液浸泡过 夜。若被油脂污染, 可用丙酣浸泡。若电极保存时间过长, 校正数值不准时, 可将电极放入 2mol/L KCl 溶液中 ,40 ℃加热 lh 以上, 进行电极活化。 pH 测定时会有几方面的误差： (1) 钠离子的干扰： 多数复合电极对 Na+ 和 H+ 都非常敏感, 尤其是高 pH 值的碱性溶 液 ,Na 的干扰更加明显。例如 , 当 Na+ 浓度为 0.1mol/L 时, 可使 pH 值偏低 0.4~ 0.5 个 单位。为减少 Na+ 对 pH 测定的干扰, 每个复合电极都应附有一条校正 Na+ 干扰的标准 曲线, 有的新式的复合电极具有 Na+ 不透过性能, 如不具备以上两个条件, 则可以将电极 内的 KCl 换成 NaCl。 (2 〉浓度效应：溶液的 pH 值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关, 因为溶 液 pH 值取决于溶液中的离子活度而不是浓度, 只有在很稀的溶液中, 离子的活度才与其浓度相 等。生化实验中经常配制比使用浓度高 10 倍的 " 贮液 ", 使用时再稀释到所需浓度，由 于浓度变化很大，溶液 pH 会有变化，因此稀释后仍需对其 pH 进行调整。 (3）温度效应：有的缓冲液的 pH 受温度影响很大，如 Tris 缓冲液，因此配制和使用都要在 同一温度下进行。 实验一：离子交换法分离氨基酸 一、实验目的 学习用阳离子交换树脂柱分离氨基酸的操作方法和基本原理。 二、实验原理
一根玻璃管使用时应注意： (1) 经常检查电极内的 4mol/L KCl 溶液的液面, 如液面过低则应补充 4mol/L KCl 溶液。 (2) 玻璃泡极易破碎, 使用时必须极为小心。 (3) 复合电极长期不用, 可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中, 平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液 中, 使用时取出, 用洗并冲洗玻璃泡部分, 然后用吸水纸吸干余水, 将电极浸入待测溶液中 , 稍加搅拌, 读数时电极应静止不动, 以免数字跳动不稳定。 (4) 使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 (5) 使用前要用标准缓冲液校正电极, 其数据见书后附录, 常用的 3 种标准缓冲液 pH 值 4.00 、 6.88 和 9.23(20 ℃ ), 精度为± 0.002pH 单位。校正时先将电极放入 6.88 的标准 缓冲液中, 用 pH 计上的 " 标准 " 旋钮校正 pH 读数, 然后取出电极洗净, 再放入 pH 值为 4.00 或 9.23 的标准缓冲液中, 用 " 斜率 " 旋钮校正 pH 读数, 如此反复多次, 直 至二 点校正正确, 再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 (6) 电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的 pH 值时, 玻璃泡表面会覆 盖一层 蛋白质膜, 不易洗净而干扰测定, 此时可用 0.1mol/L HCl 的 lInurnl 胃蛋白酶溶液浸泡过 夜。若被油脂污染, 可用丙酣浸泡。若电极保存时间过长, 校正数值不准时, 可将电极放入 2mol/L KCl 溶液中 ,40 ℃加热 lh 以上, 进行电极活化。 pH 测定时会有几方面的误差： (1) 钠离子的干扰： 多数复合电极对 Na+ 和 H+ 都非常敏感, 尤其是高 pH 值的碱性溶 液 ,Na 的干扰更加明显。例如 , 当 Na+ 浓度为 0.1mol/L 时, 可使 pH 值偏低 0.4~ 0.5 个 单位。为减少 Na+ 对 pH 测定的干扰, 每个复合电极都应附有一条校正 Na+ 干扰的标准 曲线, 有的新式的复合电极具有 Na+ 不透过性能, 如不具备以上两个条件, 则可以将电极 内的 KCl 换成 NaCl。 (2 〉浓度效应：溶液的 pH 值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关, 因为溶 液 pH 值取决于溶液中的离子活度而不是浓度, 只有在很稀的溶液中, 离子的活度才与其浓度相 等。生化实验中经常配制比使用浓度高 10 倍的 " 贮液 ", 使用时再稀释到所需浓度，由 于浓度变化很大，溶液 pH 会有变化，因此稀释后仍需对其 pH 进行调整。 (3）温度效应：有的缓冲液的 pH 受温度影响很大，如 Tris 缓冲液，因此配制和使用都要在 同一温度下进行。 实验一：离子交换法分离氨基酸 一、实验目的 学习用阳离子交换树脂柱分离氨基酸的操作方法和基本原理。 二、实验原理
离子交换层析（ion exchange chromatography，简称 ICE）是分析和制备样品混合物的液 -固相层析方法，是基于待测物质的阳离子或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合， 即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分 开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子的有效手段之一。由于带电荷不 同的各种物质对离子交换剂有不同亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和 pH 值，控制这种 亲和力，即可使这些物质依据亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。 氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 pH 值，各种氨 基酸分子结构不同，在同一 pH 值时所带电荷的性质（正、负）和多少不同，与离子交换树 脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的 效果。 三、仪器与试剂 （一）实验器材 （1）玻璃层析柱 （2）试管 （3）移液管 （4）恒压洗脱瓶 （5）部分收集器 （6）水浴锅 （7）分光光度计 （8）电炉 （二）材料与试剂 （1）苯乙烯磺酸钠型树脂（100~200 目） （2）2mol/L 盐酸溶液 （3）2mol/L 氢氧化钠溶液 （4）标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成 2mg/mL 的 0.1mol/L 盐酸溶液。 （5）混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按 1：4 比例混合。 （6）柠檬酸-氢氧化钠-盐酸溶液（pH5.8，钠离子浓度 0.45mol/L）：取柠檬酸 14.25 克、氢 氧化钠 9.30 克分别溶于水后混合，加入浓盐酸 5.25 毫升，定容至 500 毫升；4℃冰箱保存。 （7）显色剂：2 克水合茚三酮溶于 95%乙醇中，加水至 100 毫升。 四、操作步聚 （1）层析柱的准备：将强酸性阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成 Na+型后洗至中性，搅拌 1 小时后装入层析柱，使之自然降沉到一定高度，用缓冲液平衡。 （2）平衡：用 pH5.8 的柠檬酸缓冲液冲洗平衡离子交换柱，调节流速，收集洗脱液至 4 倍 床体积即可上样。 （3）加样分离：将液面缓慢放至贴近层析柱表面，由柱上端仔细加入氨基酸混合液 0.25~0.5 毫升，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，立即加入 0.5 毫升柠檬酸缓 冲液。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入 0.5 毫升柠檬酸缓冲液。如此重复两次，然 后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面）。用试管收集洗脱液，每管收集 1 毫升， 直至无氨基酸流出为止
离子交换层析（ion exchange chromatography，简称 ICE）是分析和制备样品混合物的液 -固相层析方法，是基于待测物质的阳离子或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合， 即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分 开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子的有效手段之一。由于带电荷不 同的各种物质对离子交换剂有不同亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和 pH 值，控制这种 亲和力，即可使这些物质依据亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。 氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 pH 值，各种氨 基酸分子结构不同，在同一 pH 值时所带电荷的性质（正、负）和多少不同，与离子交换树 脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的 效果。 三、仪器与试剂 （一）实验器材 （1）玻璃层析柱 （2）试管 （3）移液管 （4）恒压洗脱瓶 （5）部分收集器 （6）水浴锅 （7）分光光度计 （8）电炉 （二）材料与试剂 （1）苯乙烯磺酸钠型树脂（100~200 目） （2）2mol/L 盐酸溶液 （3）2mol/L 氢氧化钠溶液 （4）标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成 2mg/mL 的 0.1mol/L 盐酸溶液。 （5）混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按 1：4 比例混合。 （6）柠檬酸-氢氧化钠-盐酸溶液（pH5.8，钠离子浓度 0.45mol/L）：取柠檬酸 14.25 克、氢 氧化钠 9.30 克分别溶于水后混合，加入浓盐酸 5.25 毫升，定容至 500 毫升；4℃冰箱保存。 （7）显色剂：2 克水合茚三酮溶于 95%乙醇中，加水至 100 毫升。 四、操作步聚 （1）层析柱的准备：将强酸性阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成 Na+型后洗至中性，搅拌 1 小时后装入层析柱，使之自然降沉到一定高度，用缓冲液平衡。 （2）平衡：用 pH5.8 的柠檬酸缓冲液冲洗平衡离子交换柱，调节流速，收集洗脱液至 4 倍 床体积即可上样。 （3）加样分离：将液面缓慢放至贴近层析柱表面，由柱上端仔细加入氨基酸混合液 0.25~0.5 毫升，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，立即加入 0.5 毫升柠檬酸缓 冲液。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入 0.5 毫升柠檬酸缓冲液。如此重复两次，然 后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面）。用试管收集洗脱液，每管收集 1 毫升， 直至无氨基酸流出为止
（4）氨基酸的鉴定：向各管收集液中加入 1 毫升水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中加 热 15 分钟，冷至室温测定光密度值。以收集的管数为横坐标，以吸光度值 A 为纵坐标，绘 制洗脱曲线。（用以已知两种氨基酸的纯溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，将得到 的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，即可确定两个峰为何种氨基酸。） 五、思考题 1.何谓氨基酸的离子交换？本实验采用的离子交换剂属于哪一种？ 2.离子交换树脂用缓冲液平衡，为何又用缓冲液冲洗？实验中为什么要用 pH5.8 的柠檬酸缓 冲液？可不可以用其它 pH 值的缓冲液？如果可以，应选用的 pH 为多少？并阐述原理。 3.茚三酮显色剂在与氨基酸显色时，是与氨基酸的什么基团反应？反应条件是什么？显色时 为什么要沸水浴加热？显色原理是什么？ 4.本实验分离的两种氨基酸，是否可以采用阴离子交换树脂分离，如果使用阴离子树脂，条 件和结果如何？请说明原理。 5.除氨基酸外，用离子交换柱层析法还适合分离哪些物质？为什么？ 实验二：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本 操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电荷。当溶液的 pH 大于蛋白 质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋 白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动 的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度 等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结 构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的 两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程 度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在 通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时， 分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的
（4）氨基酸的鉴定：向各管收集液中加入 1 毫升水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中加 热 15 分钟，冷至室温测定光密度值。以收集的管数为横坐标，以吸光度值 A 为纵坐标，绘 制洗脱曲线。（用以已知两种氨基酸的纯溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，将得到 的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，即可确定两个峰为何种氨基酸。） 五、思考题 1.何谓氨基酸的离子交换？本实验采用的离子交换剂属于哪一种？ 2.离子交换树脂用缓冲液平衡，为何又用缓冲液冲洗？实验中为什么要用 pH5.8 的柠檬酸缓 冲液？可不可以用其它 pH 值的缓冲液？如果可以，应选用的 pH 为多少？并阐述原理。 3.茚三酮显色剂在与氨基酸显色时，是与氨基酸的什么基团反应？反应条件是什么？显色时 为什么要沸水浴加热？显色原理是什么？ 4.本实验分离的两种氨基酸，是否可以采用阴离子交换树脂分离，如果使用阴离子树脂，条 件和结果如何？请说明原理。 5.除氨基酸外，用离子交换柱层析法还适合分离哪些物质？为什么？ 实验二：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本 操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电荷。当溶液的 pH 大于蛋白 质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋 白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动 的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度 等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结 构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的 两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程 度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在 通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时， 分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的
区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层 胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶 pH=6.7—6.8，下层胶 pH＝8.9；Tris —HCI 缓冲液中的 Tris 用于维持溶液的电中性及 pH，是缓冲配对离子；CI-是前导 离子。在 pH6.8 时，缓冲液中的 Gly-为尾随离子，而在 pH＝8.9 时，Gly 的解离度 增加；这样浓缩胶和分离胶之间 pH 的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到 控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种 蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中 存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效 的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于 SDS 带 有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如 巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS 复合物；此时，蛋白质分子上所带的负 电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。 蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁 移率之间的关系是： Mr =K(10- b·m ) logMr =LogK—b·Rm， 式中 Mr ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； Rm ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在 15,000—200,000 的范围内，电泳迁移率与分子量 的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率 Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴 酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应 的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子 量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重 复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。 三 、试剂及主要器材 1．主要试剂 1)标准蛋白混合液 内含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌动蛋白(Mw 43,000)，磷酸酐 酶(Mw 30,000)和溶菌酶(Mw 14,000) 2)30％凝胶贮备液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸馏水至 100mL 3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.15g,加水溶解,6mol/L HCl 调 pH8.9,定容 100mL 4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6g,加水溶解，6mol/L HCl 调 pH6.8，并定容 到 100mL 5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用 时稀释五倍
区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层 胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶 pH=6.7—6.8，下层胶 pH＝8.9；Tris —HCI 缓冲液中的 Tris 用于维持溶液的电中性及 pH，是缓冲配对离子；CI-是前导 离子。在 pH6.8 时，缓冲液中的 Gly-为尾随离子，而在 pH＝8.9 时，Gly 的解离度 增加；这样浓缩胶和分离胶之间 pH 的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到 控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种 蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中 存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效 的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于 SDS 带 有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如 巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS 复合物；此时，蛋白质分子上所带的负 电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。 蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁 移率之间的关系是： Mr =K(10- b·m ) logMr =LogK—b·Rm， 式中 Mr ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； Rm ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在 15,000—200,000 的范围内，电泳迁移率与分子量 的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率 Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴 酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应 的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子 量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重 复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。 三 、试剂及主要器材 1．主要试剂 1)标准蛋白混合液 内含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌动蛋白(Mw 43,000)，磷酸酐 酶(Mw 30,000)和溶菌酶(Mw 14,000) 2)30％凝胶贮备液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸馏水至 100mL 3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.15g,加水溶解,6mol/L HCl 调 pH8.9,定容 100mL 4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6g,加水溶解，6mol/L HCl 调 pH6.8，并定容 到 100mL 5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用 时稀释五倍
6)10％SDS 7)10％过硫酸铵(新鲜配制) 8)1％TEMED 9)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，50％甘油 4mL，10％SDS 2mL， 巯基乙醇 0.4mL，0.1％溴酚蓝 0.4mL，加蒸馏水定溶至 10mL。 10)0.25％考马斯亮蓝 R-250 染色液：考马斯亮蓝 R-250 1.25g，50％甲醇 454mL， 冰乙酸 46mL。 11)脱色液：冰乙酸 35mL，蒸馏水 465 mL。 12)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL ) 2．实验器材 1) DYCZ-24D 垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) 2) 电泳仪 3) 长滴管及微量加样器 4) 烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cml5cm) 5) 注射器等 四 、 实验操作 1．装板 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立 起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中 程度, 即可灌胶。 2． 凝胶的聚合 分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置 10％的分离胶和 4.8％的浓 缩胶。 试剂名称 10%的分离胶/mL 4.8%的浓缩胶/mL Acr/Bis 30% 分离胶缓冲液（pH8.9） 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 水 TEMED 5 3.75 0 0.15 0.1 5 1 1.6 0 1.25 0.1 0.1 4.95 1 按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓 缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿 2cm 处为止,约 5mL。 然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约 0.5-1mL。室温放置聚合 30-40min。 待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用 长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样 品模子。 3．蛋白质样品的处理 若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取 lmg 的样品溶解于 lmL 0.5mol
6)10％SDS 7)10％过硫酸铵(新鲜配制) 8)1％TEMED 9)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，50％甘油 4mL，10％SDS 2mL， 巯基乙醇 0.4mL，0.1％溴酚蓝 0.4mL，加蒸馏水定溶至 10mL。 10)0.25％考马斯亮蓝 R-250 染色液：考马斯亮蓝 R-250 1.25g，50％甲醇 454mL， 冰乙酸 46mL。 11)脱色液：冰乙酸 35mL，蒸馏水 465 mL。 12)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL ) 2．实验器材 1) DYCZ-24D 垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) 2) 电泳仪 3) 长滴管及微量加样器 4) 烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cml5cm) 5) 注射器等 四 、 实验操作 1．装板 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立 起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中 程度, 即可灌胶。 2． 凝胶的聚合 分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置 10％的分离胶和 4.8％的浓 缩胶。 试剂名称 10%的分离胶/mL 4.8%的浓缩胶/mL Acr/Bis 30% 分离胶缓冲液（pH8.9） 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 水 TEMED 5 3.75 0 0.15 0.1 5 1 1.6 0 1.25 0.1 0.1 4.95 1 按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓 缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿 2cm 处为止,约 5mL。 然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约 0.5-1mL。室温放置聚合 30-40min。 待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用 长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样 品模子。 3．蛋白质样品的处理 若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取 lmg 的样品溶解于 lmL 0.5mol