高效液相色谱法同时测定饮料中的9种食品添加剂 作者:廊坊师范学院化学系300届毕业生祁楠 指导教师:孙欣 摘要:研究了等梯度高效液色谱法直接测定饮料中的防腐剂、甜味剂、色素的方法。采用C柱以啷醇乙酸氨 (0.ml/)一溴化四J铵o0m/),田6.0为流动相紫外检测波长为2m可在15分钟内将山梨酸、苯甲 酸、糖精、吣、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红完全分离 关键词:高效液相色谱、山霂酸、苯甲酸、糖精、吣、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红 前言:高效液相色谱(HO是上世纪6年代末7年代初,发展起来的种新型分析分离技术它 是在经典液相色谱法的基础上,引入了气相色谱的理论,采用高压输送流动相和髙灵敏度检测器 发展而成的现代化液相色谱分析方法,具有分离效率髙、选择性好、分析速度快、检测灵敏 度高、操作自动化和应用范围广等特点。 近年来,由于消费者对于食品的安全性日益的关注,食品中的各种添加剂越来越受到人们 的重视。食品添加剂指为改善食品品质和色、香、味,而加入食品中的化学合成或天然物质, 但在目前所使用的添加剂中,绝大多数为化学合成添加剂,它们是通过氧化、还原、缩合等系 列化学合成反应所得,有的具有一定毒性,有的在食品中起变态反应或转化成其它有毒物质。通 过动物实验证明有些物质有致癌、致畸形等作用,如果不加以限制使用,将对人体健康产生危 害。 髙效液相色谱具备分离效果好、灵敏度髙和重现性好等优点因此是目前食品添加剂定性、 定量分析的首选方法,本实验采用甲醇一乙酸氨(0.02ml/)—溴化四丁铵(0.007ml/)(35: 65:4,rK0)为流动相能将食品中的食用色素、防腐剂、甜味剂、抗氧化剂、兴奋剂完全分 1.实验部分 1.1仗器与试剂 ACS2000高效毛细管电泳仪液相色谱一体机(京彩科学仪器公司)、紫外可见光检测器Ⅳ DECRⅸK205)、FS霅数字计(上海精密科学仪器有限公司)、双频超声清洗机型号 SK8200H(上海科导超声仪器有限公司)、氨水溶液分析纯氨水:原子水=:9)、醋酸溶液(分析纯 醋酸:原子水=1:9 标准储备液:吣、胭脂红、柠檬黄、日落黄、苋菜红均为1.∞∞0∽~苯甲酸、山梨酸均为 5mol,咖咄因Q800gL 标准混合液:取各组分标准储备液各1ml,混合均匀后备用 1.2样品处理 选择市售饮料三种(科力福、醒目、非常甜橙)充分混匀后用虹吸法分层取样,每层各取 5oml左右,装入小口瓶中混和均匀后超声波除气lmin,用1:9氨水调节由6.0,经α2μm水相滤 膜过滤后,备用。科力福:取原样品液用原子水稀释5倍后,进行以上操作
高效液相色谱法同时测定饮料中的9种食品添加剂 作者：廊坊师范学院化学系2005届毕业生祁楠 指导教师：孙欣 摘要:研究了等梯度高效液相色谱法直接测定饮料中的防腐剂、甜味剂、色素的方法。采用C18柱以甲醇—乙酸氨 （0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L),pH 6.0为流动相,紫外检测波长为230nm,可在15分钟内将山梨酸、苯甲 酸、糖精、VC、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红完全分离。 关键词：高效液相色谱、山梨酸、苯甲酸、糖精、VC、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红 前言：高效液相色谱(HPLC)是上世纪60年代末70年代初,发展起来的一种新型分析分离技术,它 是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，采用高压输送流动相和高灵敏度检测器, 发展而成的现代化液相色谱分析方法, 具有分离效率高、 选择性好、分析速度快、 检测灵敏 度高、操作自动化和应用范围广等特点。 近年来，由于消费者对于食品的安全性日益的关注，食品中的各种添加剂越来越受到人们 的重视。 食品添加剂指为改善食品品质和色、香、味，而加入食品中的化学合成或天然物质， 但在目前所使用的添加剂中，绝大多数为化学合成添加剂，它们是通过氧化、还原、缩合等一系 列化学合成反应所得，有的具有一定毒性，有的在食品中起变态反应或转化成其它有毒物质。通 过动物实验证明有些物质有致癌、致畸形等作用，如果不加以限制使用，将对人体健康产生危 害。 高效液相色谱具备分离效果好、灵敏度高和重现性好等优点,因此是目前食品添加剂定性、 定量分析的首选方法,本实验采用甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L)（35： 65：4，pH6.0）为流动相,能将食品中的食用色素、防腐剂、甜味剂、抗氧化剂、兴奋剂完全分 离。 1. 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000高效毛细管电泳仪液相色谱一体机(北京彩陆科学仪器公司)、紫外可见光检测器(UV DETECTOR VK-2051)、PHS-2F数字pH计（上海精密科学仪器有限公司）、双频超声清洗机型号 SK8200LH(上海科导超声仪器有限公司)、氨水溶液(分析纯氨水：原子水=1：9)、醋酸溶液(分析纯 醋酸：原子水=1：9) 标准储备液：VC、胭脂红、柠檬黄、日落黄、苋菜红 均为 1.0000g/L、苯甲酸、山梨酸均为 5mmol\L，咖啡因0.8000g/L 标准混合液：取各组分标准储备液各1ml，混合均匀后备用。 1.2 样品处理 选择市售饮料三种（科力福、醒目、非常甜橙）充分混匀后用虹吸法分层取样，每层各取 50ml 左右，装入小口瓶中混和均匀后超声波除气15min，用1：9氨水调节pH 6.0,经0.2μm水相滤 膜过滤后，备用。科力福:取原样品液用原子水稀释5倍后，进行以上操作
1.3色谱条件 C柱颗粒度⑩0m、柱温16摄氏度、检测波长α30Ⅷ、流动相甲醇一乙酸氨(O.ml)一溴化 四丁铵⑩.o0m)配比35:65:4,p6.0,流速1.Ⅷm/mn,微量进样器定量进样20μl,实验以保 留时间定性,外表物法定量。 2结果与讨论 2.1淚波长选择 用紫外一可见光分光光度计检测器,检测9种物质发现其在20m-30m范围内敏感波长分别为 山梨酸糖精咖啡因苯甲酸胭脂红苋菜红。柠檬黄VC日落黄 260m 202nm206,273rm229mm215nm2l6nm257nr 234nm 兼顾九种组分在200m-300m的紫外吸收值,选择23m为检测波长。 2.2流动相选择 实验以甲醇一乙酸氨作为流动相对组分进行分离如图 (1)甲醇一乙酸氨0.0ml=30:70 图1添加剂组分拟合图 胭脂红和苯甲酸分离不开,且六种组分αw℃、柠檬黄、日落黄、胭脂红、山梨酸、苯甲酸 出峰时间集中在27min5.4min范围内,不易于最终分离测定。 (2)甲醇一乙酸氨0.02ml/=40:60 图2添加剂组分拟合图
1. 3 色谱条件 C18柱颗粒度10um、柱温16摄氏度、检测波长230nm、流动相甲醇—乙酸氨（0.02mol/L）—溴化 四丁铵(0.007mol/L)配比35:65:4 ，pH 6.0，流速1.0ml/min，微量进样器定量进样20μl,实验以保 留时间定性，外表物法定量。 2 结果与讨论 2..1检测波长选择 用紫外—可见光分光光度计检测器,检测9种物质发现其在200nm—300nm范围内敏感波长分别为 山梨酸 糖精 咖啡因 苯甲酸 胭脂红 苋菜红 柠檬黄 VC 日落黄 260nm 202nm 206，273nm 229nm 215nm 216nm 257nm 262nm 234nm 兼顾九种组分在200nm—300nm的紫外吸收值,选择230nm为检测波长。 2..2 流动相选择 实验:以甲醇—乙酸氨作为流动相[1]对[组分进行分离,如图： （1）甲醇—乙酸氨0.02mol/L =30：70 图 1 添加剂组分拟合图 胭脂红和苯甲酸分离不开，且六种组分（VC、柠檬黄、日落黄、胭脂红、山梨酸、苯甲酸） 出峰时间集中在2.7min-5.4min范围内，不易于最终分离测定。 （2）甲醇—乙酸氨0.02mol/L=40：60 图 2 添加剂组分拟合图
柠檬黄与苋菜红,出峰重叠:胭脂红与日落黄,岀峰重叠,分离效果不好,且组分峰比较集 中,不易分离测定 (3)甲醇一乙酸氨0.02ml=44:56 日落置 山梨 柠黄 图3添加剂组分拟合图 柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄四种物质岀峰重叠:苯甲酸、山梨酸岀峰干扰,且各 组分出峰时间相对集中,不易于最终分离测定。 结论:由以上三个图形显示,最佳流动相配比,介于甲醇一乙酸氨QO2mL[30:70至甲醇一乙 酸氨0.0aml/L[40:6中间的一个配比,经实验摸索最终选择甲醇一乙酸氨 Q cmol/L[35:65为 最佳配比。 (4)甲醇一乙酸氨0.02ml/=35:65 图4添加剂组分拟合图 1-柠檬黄2苋菜红3日落黄4-V5-胭脂红θ苯甲酸7山梨酸8咖啡因 由图4可知七种组分(1柠檬黄2-苋菜红3-日落黄5-胭脂红δ-苯甲酸7-山梨酸8-咖啡 因)基本分离,但是出峰时间接近,易发生干扰。 拟解决方案:添加改性剂 2.3添加改性尔溴化四铵,选择最佳添加量
柠檬黄与苋菜红，出峰重叠；胭脂红与日落黄，出峰重叠，分离效果不好，且组分峰比较集 中，不易分离测定。 （3）甲醇—乙酸氨0.02mol/L =44：56 图 3 添加剂组分拟合图 柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄四种物质出峰重叠；苯甲酸、山梨酸出峰干扰，且各 组分出峰时间相对集中，不易于最终分离测定。 结论：由以上三个图形显示，最佳流动相配比，介于甲醇—乙酸氨0.02mol/L [30：70]至甲醇—乙 酸氨 0.02mol/L [40：60]中间的一个配比，经实验摸索最终选择甲醇—乙酸氨0.02mol/L[35：65]为 最佳配比。 （4）甲醇—乙酸氨0.02mol/L=35：65 图 4 添加剂组分拟合图 1-柠檬黄 2-苋菜红 3-日落黄 4-VC 5-胭脂红 6-苯甲酸 7-山梨酸 8-咖啡因 由图 4 可知七种组分（1-柠檬黄 2-苋菜红3-日落黄 5-胭脂红6-苯甲酸 7-山梨酸8-咖啡 因）基本分离，但是出峰时间接近，易发生干扰。 拟解决方案：添加改性剂 2..3添加改性剂溴化四丁铵，选择最佳添加量
(1)甲醇—乙酸氨(0.02ml/一溴化四丁铵0.0mo/配比35:65:4 图5九种组分分离图 由图5知,加入改性剂后基本上能将九种物质分离 (2)甲醇—乙酸氨(0.02ml/)一溴化四丁铵(0.08m/)配比35:65:4 图6九种组分分离图 由图6知,糖精与苋菜红峰重叠,分离效果不佳。 (3)甲醇—乙酸氨(0.02ml/)一溴化四丁铵(0.0mo/配比35:65:4 图7九种组分分离图 由图7知,糖精与苋菜红峰重叠且与苯甲酸峰重叠趋势增加
（1）甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L)配比35：65：4 图 5 九种组分分离图 由图 5 知，加入改性剂后基本上能将九种物质分离。 （2）甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.008mol/L)配比35：65：4 图 6 九种组分分离图 由图 6 知，糖精与苋菜红峰重叠，分离效果不佳。 （3）甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.009mol/L)配比35：65：4 图 7 九种组分分离图 由图 7 知，糖精与苋菜红峰重叠且与苯甲酸峰重叠趋势增加
结论:添加改性剂—溴化四丁铵能初步将九种物质分离,原因:由于中性条件下(6左右)溴 化四丁铵带有正电荷,可以促进带负电荷的日落黄、胭脂红出峰时间增长,从而达到分离组分的要 求。溴化四丁铵量不宜过多,否则日落黄与胭脂红峰重叠,糖精、苋菜红、苯甲酸峰重叠,因此远择 流动相配比为:甲醇-乙酸氨(Q.0aml/)-溴化四丁铵(Q00ml/)=35:65:4 问题:9种组分,出峰时间相对比较集中。拟解决方案:调节流动相pH值 24流动相p值 择 p值主要决定流动相极性,调节9种组分出峰时间,能更好的将9种物质分离 (1)pH7 图8九种组分分离图 由图8知,进混合样发现糖精与胭脂红峰重叠且与苯甲酸峰有重叠趋势,日落黄与胭脂红重 叠,完全出峰时间13分钟 (2)p65 图9九种组分分离图 苋菜红与糖精分离不好,完全出峰时间1分钟
结论：添加改性剂----溴化四丁铵能初步将九种物质分离，原因[2]:由于中性条件下(pH=6左右)溴 化四丁铵带有正电荷,可以促进带负电荷的日落黄、胭脂红出峰时间增长，从而达到分离组分的要 求。溴化四丁铵量不宜过多,否则日落黄与胭脂红峰重叠,糖精、苋菜红、苯甲酸峰重叠,因此远择 流动相配比为：甲醇-乙酸氨(0.02mol/L)-溴化四丁铵(0.007mol/L)=35:65:4 问题：9 种组分，出峰时间相对比较集中。拟解决方案：调节流动相pH值 2..4 流动相pH值选择 pH 值主要决定流动相极性,调节9种组分出峰时间,能更好的将9种物质分离 （1） pH=7 图 8 九种组分分离图 由图 8 知，进混合样发现糖精与胭脂红峰重叠且与苯甲酸峰有重叠趋势，日落黄与胭脂红重 叠，完全出峰时间13分钟 （2）pH=6.5 图 9 九种组分分离图 苋菜红与糖精分离不好,完全出峰时间14分钟