7高效液相色谱技术(HPLC 高效液相色谱(HPLC: High Performance Liquid Chromatography)是化学、生物化 学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的 分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题 必不可缺少的工具。国际市场调査表明,高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大 的份额,增长速度最快 高效液相色谱的优点是:检测的分辨率和灵敏度高,分析速度快,重复性好,定量精 度高,应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点 是:价格昂贵,要用各种填料柱,容量小,分析生物大分子和无机离子困难,流动相消耗 大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1基本原理 流动 固定相流动相 C 固定相——柱内填料,流动相一—洗脱剂 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同,进行连续的无数 次的交换和分配而达到分离的过程 通常,按溶质(样品)在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类: 分配色谱:——分配系数 亲和色谱 亲和力 吸附色谱:——吸附力 离子交换色谱 离子交换能力 凝胶色谱(体积排阻色谱):——分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为
140 7 高效液相色谱技术（HPLC） 高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化 学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的 分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题 必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大 的份额，增长速度最快。 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精 度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点 是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗 大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1 基本原理 加样 流动相 固定相 流动相 A A B C B C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数 次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为：
正相色谱:固定相为极性,流动相为非极性 反相色谱:固定相为非极性,流动相为极性。用的最多,约占60~70% 固定相(柱填料) 固定相又分为两类,一类是使用最多的微粒硅胶,另一类是使用较少的高分子微球 后者的优点是强度大、化学惰性,使用pH范围大,pH=1~14,缺点是柱效较小,常用于 离子交换色谱和凝胶色谱 最常使用的全孔微粒硅胶(3~10μm)是化学键合相硅胶,这种固定相要占所有柱 填料的80%。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团(例如各种有机硅烷),键合到 硅胶表面上,取代了羟基(一OH)而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料 类型 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是2~75,若过碱(>pH7.5),硅胶会粉 碎或溶解;若过酸(<pH2),键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是:①硅胶的强度大:②微粒硅胶的了孔结构和表面积 易人为控制。③化学稳定性好 硅胶(SiO2·nH2O) QH OH Si-o-Si- 重要的键合相是:硅烷化键合相,它是硅胶与有机硅烷反应的产物 最常用的键合相键型是: Si-o-Si- F i-OH+x--Si-R SiO一 R+HX R3 硅胶有机硅烷 键合相 X一Cl,CH3O,C2H5O等 R一烷:CsH17(即C8填料),C1oH21,C18H3等 R1、R2一X、CH3等 最常用的“万能柱”填料为“Cl8”,简称“ODs”柱,即十八烷基硅烷键合硅胶填 料( Octadecylsilyl,简称ODS)。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用,它可完 成高效液相色谱70~80%的分析任务。由于Cl8(ODS)是长链烷基键合相,有较高的碳含 量和更好的疏水性,对各种类型的生物大分子有更强的适应能力,因此在生物化学分析工 作中应用的最为广泛,近年来,为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务,又发展了
141 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占 60～70％。 固定相（柱填料）： 固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。 后者的优点是强度大、化学惰性，使用 pH 范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于 离子交换色谱和凝胶色谱。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱 填料的 80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到 硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料 类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用 pH 范围是 2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉 碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是：①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和表面积 易人为控制。③化学稳定性好。 硅胶 ( SiO2• n H2O) ： OH OH —Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C R1 R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX R2 R2 硅胶 有机硅烷 键合相 X ━ Cl，CH3O，C2H5O 等。 R ━ 烷：C8H17（即 C8 填料），C10H21，C18H37 等。 R1 、R2 ━ X、CH3 等。 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填 料（Octadecylsilyl，简称 ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完 成高效液相色谱 70～80％的分析任务。由于 C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含 量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工 作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了
CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶(20~40μm) 按键合到基质上的官能团可分为: (1)反相柱:填料是非极性的,官能团为烷烃,例如:Cl8(ODS)、C8、C4等 (2)正相柱:填料是极性的,官能团为一CN氰基、一NH2氨基等 (3)离子交换键合相 阳离子官能团:-SO3H磺酸基、一COOH羧基等。 阴离子官能团:一R4N*季铵基、-氨基等 (由于硅胶基质的键合相只能在pl=2~75的范围内使用,而离子交换色谱要求 有更宽的pH范围,因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相: 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下: H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成是:“甲醇一H2O”和“乙腈一H2O”,由于乙腈的剧毒性,通常 优先考虑“甲醇一H2O”流动相 反相色谱中,溶质按其疏水性大小进行分离,极性越大疏水性越小的溶质,越不易与 非极性的固定相结合,所以先被洗脱下来。流动相的p对样品溶质的电离状态影响很大, 进而影响其疏水性,所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中,经常要加入修饰性 的离子对物质,最常用的离子对试剂是三氟乙酸(TFA),使用浓度为0.1%,使流动相的 pH值为2~3,这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介,使其疏水性增加,延长洗脱 时间,提高分辨率和分离效果 完全离子化的溶质,例如强酸或强碱,其在反相键合相上的保留值很低,近于死时间 流出,不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷(A+)相反的离子 (B-),称为对离子,加入到流动相中,使其与样品离子结合生成弱极性的离子对,即中 性缔合物,从而增强了样品的疏水性,加大了保留值,改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇 其中最常用的是正已烷,虽然其价格较贵,但80%的顺、反和邻位、对位异构体仍 然要用正相色谱来进行分离 流动相的选择原则是:①样品易溶,且溶解度尽可能大。②化学性质稳定,不损坏柱 子。③不妨碍检测器检测,紫外波长处无吸收。④粘度低,流动性好。⑤易于从其中回收 样品。⑥无毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高纯度,即色谱纯。⑧废液易处理,不污染 环境。 142
142 CH、C3、C4 等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4 等。 ⑵正相柱：填料是极性的，官能团为 －CN 氰基、－NH2 氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H 磺酸基、－COOH 羧基等。 阴离子官能团：―R4N ＋季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在 pH＝2～7.5 的范围内使用，而离子交换色谱要求 有更宽的 pH 范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相： 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常 优先考虑“甲醇—H2O”流动相。 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与 非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的 pH 对样品溶质的电离状态影响很大， 进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性 的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），使用浓度为 0.1％，使流动相的 pH 值为 2～3，这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使其疏水性增加，延长洗脱 时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间 流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A ＋）相反的离子 （B －），称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中 性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但 80％的顺、反和邻位、对位异构体仍 然要用正相色谱来进行分离。 流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱 子。③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收 样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染 环境
基本参数 1.保留值 进样 to (1)保留时间“tR”:进样至出峰的时间。 (2)死时间“to”:不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。死时间“to”的测定通常是使用 不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质,例如:正相色谱常用四氯化碳,反相色谱 常用甲醇、尿嘧啶、NaNO2、NaNO3等 (3)容量因子“k” k=-0 或:k=溶质在固定相中的量 溶质在流动相中的量 “k”是比“tR”还常用的保留值,它与柱子的大小及流速无关,只与溶质在固定 相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比(即固定相和流动相之体企积比)有关。“k” 又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比,消除了保留值的波动因素,而平衡 常数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。 k值的范围:04<k<20~30k’=2~5为佳,过大则耗时太长 (4)保留体积:VR=t·Fc(Fc--流动相的流速mL/min) VR是在t时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间:tR'=tk-to 调整保留体积:VR'=VR-VR°=tg·Fc (5)选择性指标“α””和相对保留值“a” a可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏: 进样 R(1) 相对保留值(分离因子):
143 7.2 基本参数 1. 保留值 进样 t0 tR ⑴保留时间“tR”：进样至出峰的时间。 ⑵死时间“t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。死时间“t0”的测定通常是使用 不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色谱 常用甲醇、尿嘧啶、NaNO2、NaNO3 等。 ⑶容量因子“k’”： 0 0 ' t t t k R－ ＝ 或： 溶质在流动相中的量 溶质在固定相中的量 k'＝ “k’”是比“tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定 相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。“k’” 又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而平衡 常数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。 k’值的范围： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5 为佳，过大则耗时太长。 ⑷保留体积：VR＝tR• FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min ) VR是在 tR时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－VR 0＝tR’ • FC ⑸选择性指标“α’”和相对保留值“α” α’可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏： (1) (2) ' R R t t α＝ 进样 tR(1) tR(2) 相对保留值(分离因子)：
t' (a>1.1为好) k 柱效率 定义:理论塔板数N(tg(每米柱)|nh 2σ σ—标准偏差,曲线拐点处峰宽的一半 W1 即峰高0607处峰宽的一半 为便于测量,改用半峰宽: W2(或2×△tn) 最常用的计算式: N=554 TR 另一计算式: N=16 W Wb不如W1n容易测量,因而此式用的较少 理论塔板高度 H: 柱长 N 经验式 H=2dp( dp=10 HH=20H N=5T) H=10uN=10万) dp—柱填料的颗粒直径 柱效的测定和计算: 以反相柱为例,流动相用87%(V/V)的甲醇:水,样品用苯、联苯、萘等,加快记录仪 的走纸速度,测出半峰宽W12,并由走纸速度换算为与t相同的单位“分”或“秒”,代 入公式,计算出柱效N 提高柱效的方法:①固定相填料要均一,颗粒细,装填均匀。②流动相粘度低。③低 流速。④升高柱温
144 (1) (2) (1) (2) ' ' ' ' k k t t R R α＝ ＝ ( α＞1.1 为好 ) 2. 柱效率： 定义： 理论塔板数 2 R t N＝ ( 每米柱 ) 1/2 h 2 标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半 W1/2 即峰高 0.607 处峰宽的一半 1/2 h 为便于测量，改用半峰宽： Wb W1/2( 或 2×△t1/2 ) 最常用的计算式： 2 1/ 2 5.54 W t N＝ R 另一计算式： 2 16 b R W t N＝ Wb 不如 W1/2 容易测量，因而此式用的较少。 理论塔板高度： N L H＝ L 柱长 经验式： H＝2dP ( dP＝10μ H＝20μ N＝5 万 ) ( dP＝5μ H＝10μ N＝10 万 ) dP 柱填料的颗粒直径 柱效的测定和计算： 以反相柱为例，流动相用 87％(V/V)的甲醇:水，样品用苯、联苯、萘等，加快记录仪 的走纸速度，测出半峰宽 W1/2，并由走纸速度换算为与 tR相同的单位“分”或“秒”，代 入公式，计算出柱效 N。 提高柱效的方法：①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。②流动相粘度低。③低 流速。④升高柱温