甲酸~甲酸盐缓冲液很有用,因其挥发性强,使用后可以用减压法除之。乙酸~乙 酸钠和柠檬酸~柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多,柠檬酸有三个pKa值:pKa=3.10 pKa=475,pKa3=640。琥珀酸有二个pKa值:pKa=4.18,pKa2=5.60 有机酸缓冲液的缺点是:①所有这些羧酸都是天然的代谢产物,因而对生化反应过 程可能发生干扰作用:②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子(Fe、Zn艹、Mg艹 等)结合而使缓冲液受到干扰:③这类缓冲液易与Ca离子结合,所以样品中有Ca 离子时,不能用这类缓冲液 (4)硼酸盐缓冲液 常用的有效plH范围是:pH=8.5~10,因而它是碱性范围内最常用的缓冲液,其 优点是配制方便,只使用一种试剂,缺点是能与很多代谢产物形成络合物,尤其是能与 糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰 (5)氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽,可用于pl=2.0~11.0,例如最常用的有: 甘氨酸一HCl缓冲液:pH=2.0~5.0, 甘氨酸一NaOH缓冲液:pH=80~110, 甘氨酸—Iris缓冲液:pH=8.0~10,(此缓冲液用于广泛使用的SDS一聚丙烯酰胺 凝胶电泳的电极缓冲液), 组氨酸缓冲液:pH=55~6.5, 甘氨酰胺( glycine amide)缓冲液:pl=7.8~8.8 甘氨酰甘氨酸( glycylglycine)缓冲液:pH=80~9.0 此类缓冲体系的优点是:为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点 是:①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似,也会干扰某些生物化学反应过程,如代谢过程 等。②试剂的价格较高。 (6)两性离子缓冲液( Zwitterionic buffers),又称 Goods缓冲液 1960年, NE Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为,必 须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系,这些 缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good's缓冲液可查阅 有关的资料。 ood's缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程,对酶化学反应等无 抑制作用,所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工
２１ 甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙 酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个 pKa值：pKa1＝3.10， pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二个 pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。 有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过 程可能发生干扰作用；②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、Mg++ 等）结合而使缓冲液受到干扰；③这类缓冲液易与 Ca++离子结合，所以样品中有 Ca++ 离子时，不能用这类缓冲液。 ⑷ 硼酸盐缓冲液 常用的有效 pH 范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其 优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与 糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 ⑸ 氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽，可用于 pH=2.0～11.0，例如最常用的有： 甘氨酸—HCl 缓冲液：pH=2.0～5.0， 甘氨酸—NaOH 缓冲液：pH=8.0～11.0， 甘氨酸—Tris 缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的 SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳的电极缓冲液）， 组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5， 甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.8～8.8， 甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液：pH=8.0～9.0。 此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点 是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程 等。②试剂的价格较高。 ⑹ 两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称 Good’s 缓冲液 1960 年，N.E.Good 和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必 须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些 缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列 Good’s 缓冲液可查阅 有关的资料。 Good’s 缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无 抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对 pH 敏感的蛋白质和酶的研究工
作。其缺点是:①价格昂贵,②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowy法不适用,因为 它们会使空白管的颜色加深 16.3pH值的测定 测定溶液pH值通常有两种方法,最简便但较粗略的方法是用pH试纸,分为广泛 和精密pH试纸两种。广泛pH试纸的变色范围是pH=1~14、9~14等,只能粗略确定 溶液的pH值。另一种是精密pH试纸,可以较精确地测定溶液的pH值,其变色范围是 2~3个pH单位,例如有pH=14-3.0、0.5~50、54~70、76~85、80~10.0、9.5 130等许多种,可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸 条剪成小块,用镊子夹一小块试纸(不可用手拿,以免污染试纸),用玻璃棒蘸少许溶 液与试纸接触,试纸变色后与色阶板对照,估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入 溶液中,以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放 在有盖的容器中,以免受到实验室内各种气体的污染 精确测定溶液p值要使用pH计,其精确度可达0.005pH单位,关键是要正确选 用和校对pH电极。过去是使用两个电极,即玻璃电极和参比电极(甘汞或银一氯化银 电极),现在它们已淘汰,被两种电极合一的复合电极所代替。 玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感,其头部为一薄玻璃泡,内装有0NHCl,上 部由银~氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时,薄玻璃泡内外两侧的 电位差取决于溶液的pH,即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度(活度)的 变化而变化 参比电极的功能是提供一个恒定的电位,作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位 差的参照。常用的参比电极是甘汞电极(Hg/HgCl)或银一氯化银电极(Ag/AgCl)。参 比电极电位是氯离子浓度的函数,因而电极内充以4MKCl或饱和KCl,以保持恒定的 氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶,以 使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响 现在pl测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极,即将它们共同组装在 一根玻璃管或塑料管内,下端玻璃泡处有保护罩,使用十分方便,尤其是便于测定少量 液体的pH值
２２ 作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和 Lowry 法不适用，因为 它们会使空白管的颜色加深。 1.6.3 pH 值的测定 测定溶液 pH 值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用 pH 试纸，分为广泛 和精密 pH 试纸两种。广泛 pH 试纸的变色范围是 pH=1～14、9～14 等，只能粗略确定 溶液的 pH 值。另一种是精密 pH 试纸，可以较精确地测定溶液的 pH 值，其变色范围是 2～3 个 pH 单位，例如有 pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～ 13.0 等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸 条剪成小块，用镊子夹一小块试纸（不可用手拿，以免污染试纸），用玻璃棒蘸少许溶 液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测 pH 值。切不可将试纸直接放入 溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放 在有盖的容器中，以免受到实验室内各种气体的污染。 精确测定溶液 pH 值要使用 pH 计，其精确度可达 0.005pH 单位，关键是要正确选 用和校对 pH 电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极（甘汞或银—氯化银 电极），现在它们已淘汰，被两种电极合一的复合电极所代替。 玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感，其头部为一薄玻璃泡，内装有 0.1N HCl，上 部由银～氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时，薄玻璃泡内外两侧的 电位差取决于溶液的 pH，即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度（活度）的 变化而变化。 参比电极的功能是提供一个恒定的电位，作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位 差的参照。常用的参比电极是甘汞电极（Hg/HgCl）或银—氯化银电极（Ag/AgCl）。参 比电极电位是氯离子浓度的函数，因而电极内充以 4M KCl 或饱和 KCl，以保持恒定的 氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和 KCl 是为使电极内沉积有部分 KCl 结晶，以 使 KCl 的饱和浓度不受温度和湿度的影响。 现在 pH 测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极，即将它们共同组装在 一根玻璃管或塑料管内，下端玻璃泡处有保护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量 液体的 pH 值
(A)玻璃电极 (B)复合电极(C)参比电极(银一氯化银电极) 图1-3pH电极示意图 测定pH值时,玻璃电极和参比电极同时浸入溶液中,构成一个“全电池”,如下 图所示: pH计 Ag/ AgCI HCI0.moL)样品|4moKc或| Ag/AgCl或 溶液·饱和KCl Hg/HgCl 玻璃电极 参比电极
２３ (A) 玻璃电极 (B) 复合电极 (C) 参比电极（银－氯化银电极） 图 1－3 pH 电极示意图 测定 pH 值时，玻璃电极和参比电极同时浸入溶液中，构成一个“全电池”，如下 图所示： pH 计 Ag/AgCl HCl( 0.1mol/L) 样品 4mol/L KCl 或 Ag/AgCl 或 溶液 饱和 KCl Hg/HgCl 玻璃电极 参比电极
使用时应注意: (1)经常检查电极内的4 mol/L KCl溶液的液面,如液面过低则应补充4mo/LKCl 溶液 (2)玻璃泡极易破碎,使用时必须极为小心 (3)复合电极长期不用,可浸泡在2 mol/L KCl溶液中,平时可浸泡在无离子水或 缓冲溶液中,使用时取出,用洗并冲洗玻璃泡部分,然后用吸水纸吸干余水,将电极浸 入待测溶液中,稍加搅拌,读数时电极应静止不动,以免数字跳动不稳定 (4)使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中 (5)使用前要用标准缓冲液校正电极,其数据见书后附录,常用的三种标准缓冲液 是pH=400、688和923(20℃),精度为±0.002pH单位。校正时先将电极放入6.88 的标准缓冲液中,用pH计上的“标准”旋钮校正p读数,然后取出电极洗净,再放 入400或923的标准缓冲液中,用“斜率”旋钮校正pH读数,如此反复多次,直至 二点校正正确,再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 6)电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时,玻璃泡表面会覆 盖一层蛋白质膜,不易洗净而干扰测定,此时可用0. Imol/L HCl的1mgmL胃蛋白酶 溶液浸泡过夜。若被油脂污染,可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长,校正数值不准时, 可将电极放入2 Mol/L KCI溶液中,40℃加热一小时以上,进行电极活化 pH测定时会有几方面的误差 (1)钠离子的干扰:多数复合电极对Na和H都非常敏感,尤其是高pH值的碱性 溶液,Nat的干扰更加明显。例如,当Nat浓度为0. Imol/L时,可使pH值偏低0.4 0.5单位。为减少Na对pH测定的干扰,每个复合电极都应附有一条校正Na干扰的标 准曲线,有的新式的复合电极具有Na不透过性能,如无以上两个条件,则可以将电极 内的KCl换成NaCl (2)浓度效应:溶液的pH值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关,因为 溶液pH值取决于溶液中的离子活度而不是浓度,只有在很稀的溶液中,离子的活度才 与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高十倍的“贮液”,使用时再稀释到所 需浓度,由于浓度变化很大,溶液pH会有变化,因而稀释后仍需对其pH进行调整。 (3)温度效应:有的缓冲液的pH值受温度影响很大,如“Tris”缓冲液,因而配制 和使用都要在同一温度下进行
２４ 使用时应注意： ⑴经常检查电极内的 4mol/L KCl 溶液的液面，如液面过低则应补充 4mol/L KCl 溶液。 ⑵玻璃泡极易破碎，使用时必须极为小心。 ⑶复合电极长期不用，可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中，平时可浸泡在无离子水或 缓冲溶液中，使用时取出，用洗并冲洗玻璃泡部分，然后用吸水纸吸干余水，将电极浸 入待测溶液中，稍加搅拌，读数时电极应静止不动，以免数字跳动不稳定。 ⑷使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 ⑸使用前要用标准缓冲液校正电极，其数据见书后附录，常用的三种标准缓冲液 是 pH=4.00、6.88 和 9.23（20℃），精度为±0.002pH 单位。校正时先将电极放入 6.88 的标准缓冲液中，用 pH 计上的“标准”旋钮校正 pH 读数，然后取出电极洗净，再放 入 4.00 或 9.23 的标准缓冲液中，用“斜率”旋钮校正 pH 读数，如此反复多次，直至 二点校正正确，再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 ⑹电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的 pH 值时，玻璃泡表面会覆 盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用 0.1mol/L HCl 的 1mg/mL 胃蛋白酶 溶液浸泡过夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长，校正数值不准时， 可将电极放入 2mol/L KCl 溶液中，40℃加热一小时以上，进行电极活化。 pH 测定时会有几方面的误差： ⑴钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和 H+ 都非常敏感，尤其是高 pH 值的碱性 溶液，Na+ 的干扰更加明显。例如，当 Na+ 浓度为 0.1mol/L 时，可使 pH 值偏低 0.4～ 0.5 单位。为减少 Na+ 对 pH 测定的干扰，每个复合电极都应附有一条校正 Na+干扰的标 准曲线，有的新式的复合电极具有 Na+ 不透过性能，如无以上两个条件，则可以将电极 内的 KCl 换成 NaCl。 ⑵浓度效应： 溶液的 pH 值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关，因为 溶液 pH 值取决于溶液中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离子的活度才 与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高十倍的“贮液”，使用时再稀释到所 需浓度，由于浓度变化很大，溶液 pH 会有变化，因而稀释后仍需对其 pH 进行调整。 ⑶温度效应：有的缓冲液的 pH 值受温度影响很大，如“Tris”缓冲液，因而配制 和使用都要在同一温度下进行
1.7生化实验室的基本设施与装备 17.1温度与环境设施 许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作,因此,一个正规的生化实验 室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件,实验室都应装备空调和加湿器 等,而仪器分析室则要求保持干燥,一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由 于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不同的温度下保存,实验室必须备有4℃ 一20℃、一80℃的冰箱,需要在更低温度下保存的样品,则须使用液氮罐。对于需在较 高温度下进行的操作,则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰,以便使用乙 醇~干冰浴进行样品的快速冷冻分装。 17.2实验室用纯水 生化实验室使用最多的溶剂是“水”,配制生化实验用试剂不能用自来水,只能使 用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的,通常可以认为,水的质量 越高,实验的结果就越真实可靠和准确,为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯 水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质,如15~ l8MΩ-cm高纯无离子水、无热源高纯水、无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。 实验室制备无离子水,通常使用聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂和聚苯乙烯 季胺型强碱性阴离子交换树脂填充的阳离子和阴离子交换柱,或是阴、阳离子交换树脂 的比例为2:1的混合柱。无离子水的水质用电阻率表示,最高纯度是18MQ-cm (25℃)。虽然无离子水中阴、阳离子的含量可以很低,但用离子交换法却不能去除水 中的有机物杂质,离子交换树脂中的低分子有机化合物亦可能溶于水,因此由无离子水 的电阻率不能看出水中有机物的污染程度,有机物的污染有可能干扰生化实验中的某些 反应,也会使水的紫外吸收增加,对于那些对紫外吸收要求十分严格的实验,应选用蒸 馏水而不用无离子水 实验室中制备蒸馏水,多采用石英管加热的硬质玻璃蒸馏水器,蒸馏时不能用自来 水,因为会产生水垢,最好用无离子水作为水源。如欲除去有机物,可在蒸馏水器中每 升水加1g高锰酸钾和mL85%的磷酸,以便通过氧化除去有机物。不含金属离子的水, 需用亚沸蒸馏水,即用石英亚沸蒸馏器进行蒸馏,其特点是在液面上方加热,但水并不 沸腾,只是液面处于亚沸状态,可将水蒸气带岀的杂质减至最低,但制水量较小,每小 时约1~4升 实验工作中不应盲目追求水的纯度,水的价格随水质的提高而成倍地增长,因此要
２５ 1.7 生化实验室的基本设施与装备 1.7.1 温度与环境设施 许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作，因此，一个正规的生化实验 室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室都应装备空调和加湿器 等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由 于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不同的温度下保存，实验室必须备有 4℃、 －20℃、－80℃的冰箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。对于需在较 高温度下进行的操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰，以便使用乙 醇～干冰浴进行样品的快速冷冻分装。 1.7.2 实验室用纯水 生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用试剂不能用自来水，只能使 用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量 越高，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯 水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如 15～ 18 MΩ-cm 高纯无离子水、无热源高纯水、无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。 实验室制备无离子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂和聚苯乙烯 季胺型强碱性阴离子交换树脂填充的阳离子和阴离子交换柱，或是阴、阳离子交换树脂 的比例为 2∶1 的混合柱。无离子水的水质用电阻率表示，最高纯度是 18 MΩ-cm （25℃）。虽然无离子水中阴、阳离子的含量可以很低，但用离子交换法却不能去除水 中的有机物杂质，离子交换树脂中的低分子有机化合物亦可能溶于水，因此由无离子水 的电阻率不能看出水中有机物的污染程度，有机物的污染有可能干扰生化实验中的某些 反应，也会使水的紫外吸收增加，对于那些对紫外吸收要求十分严格的实验，应选用蒸 馏水而不用无离子水。 实验室中制备蒸馏水，多采用石英管加热的硬质玻璃蒸馏水器，蒸馏时不能用自来 水，因为会产生水垢，最好用无离子水作为水源。如欲除去有机物，可在蒸馏水器中每 升水加 1g 高锰酸钾和 1mL 85％的磷酸，以便通过氧化除去有机物。不含金属离子的水， 需用亚沸蒸馏水，即用石英亚沸蒸馏器进行蒸馏，其特点是在液面上方加热，但水并不 沸腾，只是液面处于亚沸状态，可将水蒸气带出的杂质减至最低，但制水量较小，每小 时约 1～4 升。 实验工作中不应盲目追求水的纯度，水的价格随水质的提高而成倍地增长，因此要