实验八离子交换柱层析分离核苷酸 、实验目的 本实验以酵母RNA为材料,将RNA用碱水解成单核苷酸,再用离子交换柱层析进 行分离,最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量,可以计算出 酵母RNA的碱基组成 本实验的目的是 1.了解掌握RNA碱水解的原理和方法 2.掌握离子交换柱层析的分离原理和方法 3.熟练掌握紫外吸收分析方法 二、实验原理 1.RNA的碱水解 实验室制备单核苷酸一般用化学水解法(酸、碱水解)和酶解法。RNA用酸水解 可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基:用碱水解可得到2一核苷酸和3'一核苷酸的混合物:用 磷酸二酯酶或3′一磷酸二酯酶水解则分别可得到5一核苷酸或3'一核苷酸。 RNA用碱水解,经过2、3′一环核苷酸中间物,而后水解生成2′一核苷酸和3 核苷酸。如下图所示。 碱水解一般采用0.3M的KOH,37℃保温18~20小时就能水解完全(也可以用1M KOH,80℃水解60min或0.MKOH100℃水解20min)。水解毕,用2MHCO4中和并 逐滴调节至pH=2左右,生成的KClO4沉淀,离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混 合液。然后根据所选离子交换剂的类型,将上清液调至适当的pH值,作样品液备用 一般用阳离子交换剂,pH调至1.5左右,用阴离子交换剂,pH调至8~9(逐滴)。此处 用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。 2.单核苷酸的离子交换柱层析分离 离子交换层析是根据各种物质带电状态(或极性)的差别来进行分离的。电荷不 同的物质对离子交换剂有不同的亲和力,因此,要成功地分离某种混合物,必须根据其 所含物质的解离性质,带电状态选择适当类型的离子交换剂,并控制吸附和洗脱条件(主 要是洗脱液的离子强度和pH值),使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中 洗脱下来 212
212 实验八 离子交换柱层析分离核苷酸 一、实验目的 本实验以酵母 RNA 为材料，将 RNA 用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进 行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出 酵母 RNA 的碱基组成。 本实验的目的是： 1. 了解掌握 RNA 碱水解的原理和方法 2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法 3. 熟练掌握紫外吸收分析方法 二、实验原理 1. RNA 的碱水解 实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA 用酸水解 可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到 2'一核苷酸和 3'一核苷酸的混合物；用 5'一磷酸二酯酶或 3'一磷酸二酯酶水解则分别可得到 5'一核苷酸或 3'一核苷酸。 RNA 用碱水解，经过 2'、3'一环核苷酸中间物，而后水解生成 2'一核苷酸和 3'一 核苷酸。如下图所示。 碱水解一般采用 0.3M 的 KOH，37℃保温 18~20 小时就能水解完全（也可以用 1M KOH，80℃水解 60min 或 0.1M KOH 100℃水解 20min）。水解毕，用 2M HClO4 中和并 逐滴调节至 pH=2 左右，生成的 KClO4 沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混 合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的 pH 值，作样品液备用。 一般用阳离子交换剂，pH 调至 1.5 左右，用阴离子交换剂，pH 调至 8 ~ 9(逐滴)。此处 用 KOH 是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。 2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离 离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。电荷不 同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其 所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主 要是洗脱液的离子强度和 pH 值）,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中 洗脱下来
在离子交换层析中,分配系数或平衡常数(Kd)是一个重要的参数: Kd=Cs/Cm 式中:Cs是某物质在固定相(交换剂)上的摩尔浓度,Cm是该物质在流动相中的 摩尔浓度。可以看出,与交换剂的亲和力越大,Cs越大,Kd值也越大。各种物质Kd 值差异的大小决定了分离的效果。差异越大,分离效果越好。影响Kd值的因素很多 如被分离物带电荷多少,空间结构因素,离子交换剂的非极性亲和力大小,温度高低等 实验中必须反复摸索条件,才能得到最佳分离效果。 核苷酸分子中各基团的解离常数(pK)和等电点pI值见表1。 表1四种核苷酸的解高常数(pK)和等电点pl值 含氮环的亚氨基 核苷酸 第一磷酸基第二磷酸基 (一NH+=) 等电点 pKar pKas pl值 尿苷酸UMP 1.0 6.4 鸟苷酸GMP 0.7 6.1 2.4 155 腺苷酸AMP 0.9 6.2 3.7 2.35 胞苷酸CMP 0.8 6.3 4.5 2.65 *注:pl=(pKa+pKa)/2 由表1可见含氮环亚氨基的解离常数(pK)值相差较大,它在离子交换分离四 种核苷酸中将起决定作用。 用离子交换树脂分离核苷酸,可通过调节样品溶液的pH值使它们的可解离基团解 离,带上正电荷或负电荷。同时减少样品溶液中除核苷酸外的其它离子的强度。这样, 214
214 在离子交换层析中，分配系数或平衡常数（Kd）是一个重要的参数： Kd = Cs / Cm 式中：Cs 是某物质在固定相（交换剂）上的摩尔浓度，Cm 是该物质在流动相中的 摩尔浓度。可以看出，与交换剂的亲和力越大，Cs 越大，Kd 值也越大。各种物质 Kd 值差异的大小决定了分离的效果。差异越大，分离效果越好。影响 Kd 值的因素很多， 如被分离物带电荷多少，空间结构因素，离子交换剂的非极性亲和力大小，温度高低等。 实验中必须反复摸索条件，才能得到最佳分离效果。 核苷酸分子中各基团的解离常数（pK）和等电点 p I 值见表 1。 表 1 四种核苷酸的解离常数（pK）和等电点 pI 值 核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮环的亚氨基 （－NH+ =） pKa3 等电点 pI 值* 尿苷酸 UMP 鸟苷酸 GMP 腺苷酸 AMP 胞苷酸 CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1 6.2 6.3 2.4 3.7 4.5 1.55 2.35 2.65 *注：pI = (pKa1 + pKa3) / 2 由表 1 可见,含氮环亚氨基的解离常数（ pK ）值相差较大，它在离子交换分离四 种核苷酸中将起决定作用。 用离子交换树脂分离核苷酸，可通过调节样品溶液的 pH 值使它们的可解离基团解 离，带上正电荷或负电荷。同时减少样品溶液中除核苷酸外的其它离子的强度。这样
当样品液加入到层析柱时,核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时,通过改变pH 值或增加洗脱液中竞争性离子的强度,使被吸附的核苷酸的相应电荷降低,与树脂的亲 和力降低,结果使核苷酸得到分离。 混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时,控制样 品液pH值在15,此时UMP带负电,而AMP、CMP、GMP带正电,可被阳离子树脂 吸附。然后通过逐渐升高pH值,将各核甘酸洗脱下来,次序是UMP- GMP-CMP-AMP。 AMP与CMP洗脱位置的互换,是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大 于对嘧啶碱基的吸附力造成的。 本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂(201×8)分离四 种核苷酸首先使RNA碱水解液中的其它离子强度降至002以下,然后调pl值至6以 上,使样品核苷酸都带上负电荷,它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱 与核苷酸的pl值有关,pl越大,与阴离子交换树脂的结合力越弱,洗脱时越易交 换下来。由表1可见,当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时,洗脱下来的次序应该是 CMP、AMP、GMP和UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的,它与嘌 呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以,实际洗脱下来的次序为 CMP、AMP、UMP和GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言,它们之间的差别仅 在于磷酸基位于核糖的不同位置上,2-一磷酸基较3—磷酸基距离碱基更近,因而它的 负电性对碱基正电荷的电中和影响较大,其pK值也较大。例如2-胞苷酸的pK1=44 3-胞苷酸的pK1=4.3,因此2一核苷酸更易被洗脱下来。 应注意的是,样品不易过浓,洗脱的流速不宜过快,洗脱液的pH值要严格控制 否则将使吸附不完全,洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。 3.核苷酸的鉴定 由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基,这些碱基都具有共轭双键(-C=CC=C ),它能够强烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光,而且有特征的紫外吸收比值 因此,通过测定各洗脱峰溶液在220~300毫微米波长范围内的紫外吸收值,作出紫外吸 收光谱图,与下图所示的标准吸收光谱进行比较,并根据其吸光度比值(250nm/260nm, 280nm/26onm,290nm/260m)以及最大吸收峰与下页“表2”所列标准值比较后,即可 判断各组分为何种核苷酸。 根据各组分在其最大吸收波长(mx)处总的吸光度(总Amax)以及相应的摩尔消 光系数(E260m),可以计算出RNA中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成
215 当样品液加入到层析柱时，核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时，通过改变 pH 值或增加洗脱液中竞争性离子的强度，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低，与树脂的亲 和力降低，结果使核苷酸得到分离。 混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时，控制样 品液 pH 值在 1.5，此时 UMP 带负电，而 AMP、CMP、GMP 带正电，可被阳离子树脂 吸附。然后通过逐渐升高 pH 值，将各核甘酸洗脱下来，次序是 UMP-GMP-CMP-AMP。 AMP 与 CMP 洗脱位置的互换，是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大 于对嘧啶碱基的吸附力造成的。 本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂（201×8）分离四 种核苷酸.首先使 RNA 碱水解液中的其它离子强度降至 0.02 以下，然后调 pH 值至 6 以 上，使样品核苷酸都带上负电荷，它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱， 与核苷酸的 pI 值有关，pI 越大，与阴离子交换树脂的结合力越 弱，洗脱时越易交 换下来。由表 1 可见，当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时，洗脱下来的次序应该是 CMP、AMP、GMP 和 UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的,它与嘌 呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以，实际洗脱下来的次序为： CMP、AMP、UMP 和 GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言，它们之间的差别仅 在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2'—磷酸基较 3'—磷酸基距离碱基更近，因而它的 负电性对碱基正电荷的电中和影响较大,其 pK 值也较大。例如 2'-胞苷酸的 pK1=4.4 ， 3'-胞苷酸的 pK1 = 4.3 ，因此 2'一核苷酸更易被洗脱下来。 应注意的是，样品不易过浓，洗脱的流速不宜过快，洗脱液的 pH 值要严格控制。 否则将使吸附不完全，洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。 3. 核苷酸的鉴定 由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（—C=C—C=C —），它能够强烈地吸收 250~280 毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。 因此，通过测定各洗脱峰溶液在 220~300 毫微米波长范围内的紫外吸收值，作出紫外吸 收光谱图，与下图所示的标准吸收光谱进行比较，并根据其吸光度比值（250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰与下页“表 2”所列标准值比较后，即可 判断各组分为何种核苷酸。 根据各组分在其最大吸收波长（max）处总的吸光度（总 Amax ）以及相应的摩尔消 光系数（E260 nm）, 可以计算出 RNA 中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成
四种核苷酸在pH=2~4时的紫外吸收光谱曲线 (1)某核苷酸微摩尔数、该核苷酸峰合并液A×该峰体积(m/)×103 该核苷酸E260m 该核苷酸微摩尔数 (2)某碱基%三四种核香酸微摩尔总数×100 溶液的pH值对核苷酸的紫外吸收光度值影响较大,故测定时需要调至一定的pH 值 三、试剂与器材 试剂: 1.酵母RNA 2.强碱型阴离子交换树脂201×8。聚苯乙烯一二乙烯苯一三甲胺季铵碱型, 217
217 四种核苷酸在 pH = 2 ~ 4 时的紫外吸收光谱曲线 （1） E nm A ml 260 3 max ( ) 10 该核苷酸 该核苷酸峰合并液 该峰体积 某核苷酸微摩尔数＝ （2） ％ 四种核苷酸微摩尔总数 该核苷酸微摩尔数 某碱基％＝ 100 溶液的 pH 值对核苷酸的紫外吸收光度值影响较大，故测定时需要调至一定的 pH 值。 三、试剂与器材 试剂： 1. 酵母 RNA 2. 强碱型阴离子交换树脂 201×8。聚苯乙烯 一 二乙烯苯 一 三甲胺季铵碱型
全交换量大于3毫摩尔/克干树脂,粉末型100~200目 3.IM甲酸:214ml88%甲酸定容至500ml。 4.IM甲酸钠:34.15g纯甲酸钠(注意结晶水问题)用蒸餾水溶解,定容至500ml 5.0.3MKOH:1.68gKOH用蒸餾水溶解定容至100ml。 6.2M过氯酸HCO4:17m过氯酸(70~72%)定容至100ml 7. 2 M NaOH(50ml), 0.5 MNaOH (100ml) 8. IM HCI(100ml) 9.1%AgNO3溶液 器材: 1.层析柱 2.梯度洗脱器,电磁搅拌器 3.恒流泵 4.自动部分收集器 5.酸度计 6.紫外分光光度计 7.旋涡混合器 8.核酸蛋白检测仪 9.台式离心机 四、操作步骤 1.RNA的碱水解 称取20mg酵母RNA,置于刻度离心试管中,加2m新配制的03MKOH用细玻 璃棒搅拌溶解,于37℃水浴中保温水解20小时。然后用2 MHCIO4(过氯酸)调水解 液pH至2以下(要少量多次,只需几滴即可)。由于核苷酸在过酸的条件下易脱嘌呤, 所以滴加HCIO4时需用旋涡混合器迅速搅拌,防止局部过酸,再以4000转/分的转速离 心15分钟,置冰浴中10分钟,以沉淀完全。将清液倒入另一刻度试管中,用2 M Naoh 逐滴将清液pH值调至8~9,作上样样品液备用。样品液上柱前,取O.ml稀释到500 倍,测定其在260mm波长处的光吸收值,用以最后计算离子交换柱层析的回收率。 2.高子交换树脂的预处理 取201×8粉末型强碱型阴离子交换树脂8克(湿),先用蒸馏水浸泡2小时,浮选 除去细小颗粒,同时用减压法除去树脂中存留的气泡,然后用四倍树脂量的O.5 M NaOH 218
218 全交换量大于 3 毫摩尔/克干树脂，粉末型 100~200 目。 3. 1M 甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至 500ml。 4. 1M 甲酸钠：34.15g 纯甲酸钠（注意结晶水问题）用蒸餾水溶解，定容至 500ml。 5. 0.3 M KOH: 1.68g KOH 用蒸餾水溶解定容至 100ml。 6. 2 M 过氯酸 HClO4：17ml 过氯酸( 70~72 % )定容至 100ml。 7. 2 M NaOH (50ml)，0.5 M NaOH (100ml)。 8. 1M HCl（100ml）。 9. 1% AgNO3 溶液。 器材： 1. 层析柱 2. 梯度洗脱器，电磁搅拌器 3. 恒流泵 4. 自动部分收集器 5. 酸度计 6. 紫外分光光度计 7. 旋涡混合器 8. 核酸蛋白检测仪 9. 台式离心机 四、操作步骤 1. RNA 的碱水解： 称取 20mg 酵母 RNA，置于刻度离心试管中，加 2ml 新配制的 0.3 M KOH, 用细玻 璃棒搅拌溶解，于 37℃水浴中保温水解 20 小时。然后用 2M HClO4（过氯酸）调水解 液 pH 至 2 以下（要少量多次，只需几滴即可）。由于核苷酸在过酸的条件下易脱嘌呤， 所以滴加 HClO4 时需用旋涡混合器迅速搅拌，防止局部过酸，再以 4000 转/分的转速离 心 15 分钟，置冰浴中 10 分钟，以沉淀完全。将清液倒入另一刻度试管中，用 2 M NaOH 逐滴将清液 pH 值调至 8～9，作上样样品液备用。样品液上柱前，取 0.1ml 稀释到 500 倍，测定其在 260nm 波长处的光吸收值，用以最后计算离子交换柱层析的回收率。 2. 离子交换树脂的预处理： 取 201×8 粉末型强碱型阴离子交换树脂 8 克（湿），先用蒸馏水浸泡 2 小时，浮选 除去细小颗粒，同时用减压法除去树脂中存留的气泡，然后用四倍树脂量的 0.5M NaOH