〔Ⅲ〕实验部分 实验一蛋白质含量测定法 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和 优缺点。 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法( Biuret法)、 Folin-酚试剂法(Lowy 法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝 法( Bradford法)。其中 Bradford法和Lowy法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比 Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定 的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质 值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为 种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完 美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确 度:②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质:④测定所要花费的时间 考马斯亮蓝法( Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 、微量凯氏( Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫 酸氨。经强碱碱化使之分解放岀氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度 可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下 CH, COOH +3H2SO4-> 2C02+3S02 +4H20 +NH3 (1) H 2NH3 H2SO4-)(NH4)2SO4 (NH4)2SO4+ 2NaoH-> 2H20+Na2SO4+ 2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用 硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 170
170 〔Ⅱ〕 实验部分 实验一 蛋白质含量测定法 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和 优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret 法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝 法（Bradford 法）。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 10～20 倍，比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定 的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为 一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完 美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确 度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford 法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫 酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度 可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入 CuSO4 作催化剂，K2SO4 以提高溶液的沸点。收集氨可用 硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得 五种蛋白质测定方法比较如下 去 灵敏度 时间原理 干扰物质说明 凯氏定氮法灵敏度低,费时将蛋白氮转化非蛋白氮用于标准蛋白 ( Kjedahl适用于02-8~10为氨,用酸吸(可用三氯质含量的准确 0mg氮,小时收后滴定 乙酸沉淀蛋测定:干扰少 误差为 白质而分费时太长 双缩脲法灵敏度低中速多肽键+碱性硫酸铵:用于快速测 (Buet法)1~20mg20-30Cu2→紫色络Tr缓冲液:定,但不太灵 分钟合物 某些氨基酸敏;不同蛋白 质显色相似 紫外吸收法|较为灵敏快速蛋白质中的酪各种嘌吟和用于层析柱流 50~100g5~10氨酸和色氨酸嘧啶 出液的检测 分钟残基在280mm各种核苷酸核酸的吸收可 处的光吸收 以校正 Folin-酚试灵敏度高慢速双缩脲反应:硫酸铵 耗费时间长 剂法(Lowy|~5ug 40~磷钼酸一磷钨Tris缓冲液:操作要严格计 酸试剂被Tr甘氨酸 分钟和Pe还原各种硫醇颜色深浅随不 同蛋白质变化 考马斯亮蓝灵敏度最高快速考马斯亮蓝染强碱性缓冲最好的方法 法( Bradford1~ug 5~15料与蛋白质结液 干扰物质少 分钟合时,其入mT210色稳定 颜色深浅随不 由465nm 变为sDs 同蛋白质变化
171 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 6．25 即得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （ Kjedahl 法） 灵敏度低， 适用于 0.2~ 1.0mg 氮， 误差为 2％ 费时 8 ～ 10 小时 将蛋白氮转化 为氨，用酸吸 收后滴定 非蛋白氮 （可用三氯 乙酸沉淀蛋 白质而分 离） 用于标准蛋白 质含量的准确 测定；干扰少； 费时太长 双缩脲法 （Biuret 法） 灵敏度低 1～20mg 中速 20~30 分钟 多肽键＋碱性 Cu2 ＋→紫色络 合物 硫酸铵； Tris 缓冲液； 某些氨基酸 用 于快速测 定，但不太灵 敏；不同蛋白 质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50～100g 快速 5 ～ 10 分钟 蛋白质中的酪 氨酸和色氨酸 残基在 280nm 处的光吸收 各种嘌吟和 嘧啶； 各种核苷酸 用于层析柱流 出液的检测； 核酸的吸收可 以校正 Folin－酚试 剂法（Lowry 法） 灵敏度高 ～5g 慢速 40 ～ 60 分钟 双缩脲反应； 磷钼酸－磷钨 酸试剂被 Tyr 和 Phe 还原 硫酸铵； Tris 缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长； 操作要严格计 时； 颜色深浅随不 同蛋白质变化 考马斯亮蓝 法 (Bradford 法) 灵敏度最高 1～5g 快速 5 ～ 15 分钟 考马斯亮蓝染 料与蛋白质结 合时，其max 由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲 液； TritonX-100 ; SDS 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不 同蛋白质变化
、双缩脲法( Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3 CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有 两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都 有双缩脲反应。 H2O IN------------NH CH-R C=O --NH R-CH CH-R 12O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要 有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成 l0mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度lmg/ml的A2为0.66来校正其纯度。如有 需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据 其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白 用0.05 NAoh配制 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4·5HO)和60克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6·4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液, 用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材
172 二、双缩脲法（Biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经 180℃左右加热，放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有 两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都 有双缩脲反应。 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要 有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测 定。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有 需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据 其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白 用 0．05N NaOH 配制。 （2）双缩脲试剂：称以 1.50 克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O），用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液， 用水稀释到 1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,02,0.4,0.6,0.8,10毫 升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后, 在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540mm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收 值为纵座标绘制标准曲线 2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度 注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、F。im酚试剂法( Lowry法) (一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于 其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此 法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即 Folin-酚试剂,以 增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是: ①在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。② Folin-酚试剂中的磷钼酸盐 一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合 物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比 Folin-酚试剂法最早由 Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费 时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干 扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowy反应。而且对后者的 影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干 扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%), 乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时, 必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液,即可显色测定。 若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。 进行测定时,加 f olin-酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳 定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Foli一酚试剂加到碱性的铜一蛋 白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即 能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定 此法可检测的最低蛋白质量达5。通常测定范围是20~250μug。 (二)试剂与器材 1试剂 (1)试剂甲:
173 可见光分光光度计、大试管 15 支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 12 支试管分两组，分别加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫 升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1 毫升，然后加入 4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后， 在室温（20~25℃）下放置 30 分钟，于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收 值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取 2~3 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。 注意样品浓度不要超过 10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于 其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此 法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以 增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐 —磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合 物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费 时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干 扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的 影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干 扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%）， 乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时， 必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。 若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。 进行测定时，加 F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳 定，但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋 白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即 能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5g。通常测定范围是 20~250g。 （二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲：
(A)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O·4H2O) 溶解于500毫升蒸馏水中。 (B)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将 50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲 (2)试剂乙: 在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(NaWO4·2H2O),25克钼酸钠 ( Naz Moo4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充 分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(LiSO), 50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液 呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕 色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1 倍,使最终的酸浓度为1N左右。 (3)标准蛋白质溶液 精确称取结晶牛血清淸蛋白或γ球蛋臼,溶于蒸馏水,浓度为250μg/m左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液 2.器材 (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)秒表 (4)试管16支 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分 成两组,分别加入0,0.1,0.2,04,06,0.8,10毫升标准蛋白质溶液(浓度为250ug/ml) 用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于 室温(20~25℃)放置10分钟。再逐管加入05毫升试剂乙( Folin一酚试剂),同样立 即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟, 以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。 注意:因 Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即 第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲, 2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1 支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后 加第3支试管,余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测 定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面 的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管 174
174 （A） 10 克 Na2CO3，2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。 溶解于 500 毫升蒸馏水中。 （B） 0.5 克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将 50 份（A）与 1 份（B）混合，即为试剂甲。 （2）试剂乙： 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na2WO4 ·2H2O）,25 克钼酸钠 （Na2MoO4·2H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克 硫 酸 锂（Li2SO4）， 50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液 呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕 色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1N 左右。 （3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 —球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 g/ml 左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。 2. 器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管 16 支 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其余试管分 成两组，分别加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250g/ml）。 用水补足到 1.0 毫升，然后每支试管加入 5 毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于 室温（20～25℃）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立 即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30 分钟， 以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。 注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即 第 1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙，2 分钟后 加第 3 支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测 定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面 的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管