较高的精度,吸头需予先吸取一次样品溶液,然后再正式移液,因为吸取血清蛋白质溶 液或有机溶剂时,吸头内壁会残留一层“液膜”,造成排液量偏小而产生误差。③浓度 和粘度大的液体,会产生误差,为消除其误差的补偿量,可由试验确定,补偿量可用调 节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。④可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计 算的方法,来校正取液器,1mL蒸馏水20℃时重0.9982g。 图1-2自动取液器示意图 1.6缓冲溶液与pH测定 缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响,仍能维持p值基本不变的 溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合
１６ 较高的精度，吸头需予先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶 液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。③ 浓度 和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调 节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。④ 可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计 算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水 20℃时重 0.9982g。 图 1－2 自动取液器示意图 1.6 缓冲溶液与 pH 测定 缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持 pH 值基本不变的 溶液。该溶液的这种抗 pH 变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合
物溶于溶剂(即纯水)所得的溶液,溶液内所溶解的溶质(化合物)称之为缓冲剂,调 节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。 缓冲溶液的正确配制和p值的准确测定,在生物化学的研究工作中有着极为重要 的意义,因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的,而且 受到氢离子浓度的严格调控,能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。 生物体内细胞的生长和活动需要一定的p值,体内p环境的任何改变都将引起与代 谢有关的酸碱电离平衡移动,从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确 地模拟生物体内的天然环境,就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的 pH值,此外,各种生化样品的分离纯化和分析鉴定,也必须选用合适的pH值,因此, 在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中,深刻地了解各种缓冲试剂 的性质,准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液,精确地测定溶液的pH值,就是非常重 要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值: 表1-3人体体液pH 7.35~745 大肠液 8.3~8.4 成人胃液 0.9~1.5 泪 6.6~6.9 唾液 6.3~7.1 4.8~7.5 胰液73580脑 16.1基本概念 (1) Bronsted- Lowry酸碱理论(又称酸碱质子理论)。1923年由丹麦化学家 JN. Bronsted和英国化学家 TM.Lowry同时提出了酸碱质子学说,发展了酸碱理论,被 后人称为酸碱质子理论或 Bronsted- Lowry酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离 子(如:H2O,HCl,NH4+,HSO4等)称为酸,凡能接受质子的分子或离子(如:H2O NH3,CI等)称为碱。因此,一种酸释放质子后即成为碱,称为该酸的共轭碱,同样 种碱与质子结合后,形成对应的酸,称为该碱的共轭酸。 A-H + B A+B-H 酸 碱 酸 酸1是碱的共轭酸,碱2是酸2的共轭碱
１７ 物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调 节缓冲剂的配比即可制得不同 pH 的缓冲液。 缓冲溶液的正确配制和 pH 值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要 的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的 pH 值下进行的，而且 受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。 生物体内细胞的生长和活动需要一定的 pH 值，体内 pH 环境的任何改变都将引起与代 谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确 地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的 pH 值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的 pH 值，因此， 在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂 的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的 pH 值，就是非常重 要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的 pH 值： 表 1—3 人体体液 pH 体 液 pH 体 液 pH 血 清 7.35～7.45 大肠液 8.3～8.4 成人胃液 0.9～1.5 泪 6.6～6.9 唾 液 6.3～7.1 尿 4.8～7.5 胰 液 7.5～8.0 脑脊液 7.35～7.45 1.6.1 基本概念 ⑴ Brönsted-Lowry 酸碱理论（又称酸碱质子理论）。1923 年由丹麦化学家 J.N.Brönsted 和英国化学家 T.M.Lowry 同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被 后人称为酸碱质子理论或 Brönsted-Lowry 酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离 子（如：H2O，HCl，NH4 +，HSO4 — 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O， NH3，Cl—等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样 一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 A—H ＋ B — A ＋ B—H 酸 1 碱 2 碱 1 酸 2 酸 1 是 碱 1 的共轭酸， 碱 2 是 酸 2 的共轭碱
如盐酸在水中的解离 HCl是酸,CI是它的共轭碱 (2)缓冲体系的设计: 强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子,弱电解质溶于水时,则不完全解离,只 有部分的分子解离出正负离子,其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸(HA)及其 盐溶于水时,只有部分HA解离为H和A离子,其平衡方程式如下 KI HA A+ H (1-1) K K [HTLAI [HAI [HJ=K [HA (1-2) [A (1-2)式两边取负对数: lg[h=-lg K+lg [HAI (1-3)式中:[HA]一为弱酸的浓度 一为HA解离出的氢离子浓度 [A一为HA的共轭碱的离子浓度 K1一为酸解离的速度常数 K2一为A与H缔合的速度常数 Ka一为反应方程(1-1)达平衡时HA的解离平衡常数 现将HA的pKa定义为-1gK,将HA溶液的pH定义为-log[H, (13试可写为:mH=pka+ lg jhay (1-4)
１８ 如盐酸在水中的解离： HCl Cl— ＋ H+ HCl 是酸，Cl—是它的共轭碱。 ⑵ 缓冲体系的设计： 强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只 有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其 盐溶于水时，只有部分 HA 解离为 H+ 和 A —离子，其平衡方程式如下： K1 HA A— ＋ H+ (1-1) K2 [ ] [ ][ ] HA H A Ka + − = ∴ [ ] [ ] [ ] − + = A HA H Ka (1-2) (1-2)式两边取负对数： [ ] [ ] lg[ ] lg lg HA A H Ka − + － =－ ＋ (1-3) (1-3)式中： [HA] — 为弱酸的浓度 [H+ ] — 为 HA 解离出的氢离子浓度 [A— ] — 为 HA 的共轭碱的离子浓度 K1 — 为酸解离的速度常数 K2 — 为 A —与 H+ 缔合的速度常数 Ka — 为反应方程(1-1)达平衡时 HA 的解离平衡常数 现将 HA 的 pKa 定义为 －lg Ka，将 HA 溶液的 pH 定义为 －log[H+ ]， ∴ (1-3)式可写为 ： [ ] [ ] lg HA A pH pKa − = ＋ (1-4)
或 H PKn+g离解形式 [未离解形式] 方程(1-4)称为: Henderson-Hassel- Balch方程,此方程对于生物化学学科,在理论 与实践上都具有重要意义。该方程表示了溶液pH与溶质中可解离基团pKa之间的关系 很明显,当[A]=田HA时: [H] 这就意味着当[HA]有一半解离时,溶液的p等于pKa,此弱酸一碱缓冲体系的pK 即代表缓冲范围的中点。一个缓冲体系的有效缓冲范围,通常是在pKa值为中点的两个 pH单位范围内,即:缓冲剂的有效pH范围=pka±1,所以,当缓冲溶液的pH等于该 缓冲剂的pK时,缓冲能力最大。若要设计一个新的缓冲体系时,只需按所要求的pH 值查出pKa值等于此pH值的各种缓冲剂并从中进行挑选即可 1960年, N.E. Good和他的同事们提出,适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有 以下特性 ①pkKa值在6~8之间;②在水中的溶解度高;③不易穿透生物膜;④盐效应 小;⑤离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小;⑥不与金属离子生成复合物或沉 淀:⑦该缓冲剂化学稳定;⑧紫外和可见光波长范围内光吸收小:⑨易制得高纯度 的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。 16.2生物化学常用缓冲液 (1)磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂,由於它们是二级解离,有二个 pKa值,所以用它们配制的缓冲液,pH范围最宽 NaHzPO4: pKal=2. 12, pKa2=7.21 Na2HPO4: pKal=7. 21, pKa2=12.32 配酸性缓冲液:用 Nah2Po4,pH=1~4 配中性缓冲液:用混合的两种磷酸盐,pH=6~8, 配碱性缓冲液:用Na2HPO4,pH=10~12
１９ 或： [ ] [ ] lg 未离解形式 离解形式 pH = pKa＋ (1-5) 方程(1-4)称为：Henderson-Hassel-Balch 方程，此方程对于生物化学学科，在理论 与实践上都具有重要意义。该方程表示了溶液 pH 与溶质中可解离基团 pKa之间的关系。 很明显，当[A— ]＝[HA]时： 0 [ ] [ ] lg = − HA A ∴ pH ＝ pKa 这就意味着当[HA]有一半解离时，溶液的 pH 等于 pKa，此弱酸－碱缓冲体系的 pKa 即代表缓冲范围的中点。一个缓冲体系的有效缓冲范围，通常是在 pKa值为中点的两个 pH 单位范围内，即：缓冲剂的有效 pH 范围＝pKa±1，所以，当缓冲溶液的 pH 等于该 缓冲剂的 pKa 时，缓冲能力最大。若要设计一个新的缓冲体系时，只需按所要求的 pH 值查出 pKa值等于此 pH 值的各种缓冲剂并从中进行挑选即可。 1960 年，N.E.Good 和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有 以下特性： ① pKa值在 6～8 之间； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 盐效应 小；⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；⑥ 不与金属离子生成复合物或沉 淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定；⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小；⑨ 易制得高纯度 的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。 1.6.2 生物化学常用缓冲液 ⑴ 磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个 pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4， 配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12
用钾盐比钠盐好,因为低温时钠盐难溶,钾盐易溶,但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳的缓冲液时,只能用磷酸钠而不能用磷酸钾,因为SDS(十二烷基硫酸钠)会与 钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为:①容易配制成各种浓度的缓冲液:②适用的pH范围宽; ③pH受温度的影响小;④缓冲液稀释后pH变化小,如稀释十倍后pH的变化小于0.1 其缺点为:①易与常见的钙Ca离子、镁Mg艹离子以及重金属离子缔合生成沉淀 ②会抑制某些生物化学过程,如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 (2)Iris(三羟甲基氨基甲烷,N- Tris( hydroxymethyl)aminomethane)缓冲液 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多,有超过磷酸盐缓冲液的趋势,如在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液,而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围,例如 Tris-HCl缓冲液 pH=7.5~8.5 Tis磷酸盐缓冲液:pH=5.0~9.0 配制常用的缓冲液的方法有两种:①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法,分别 配制005 mol/L Tris和0.05 mol/L HCI溶液,然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的 稀盐酸不易配制,所以常用另一种方法;②若配1L0. Imol/L的Tris-HCl缓冲液:先 称12. Ig Tris碱溶于950mL~970mL无离子水中,边搅拌边滴加4NHCl,用pH计测 定溶液pH值至所需的pH值,然后再加水补足到1L Tris-HCl缓冲液的优点是:①因为Tris碱的碱性较强,所以可以只用这一种缓冲 体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液;②对生物化学过程干扰很小, 不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是:①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大,缓冲液稀释十倍,p值的变化 大于0.1:②温度效应大,温度变化对缓冲液pH值的影响很大,即: △pKa/℃=-0.031,例如:4℃时缓冲液的pH=84,则37℃时的pH=74,所以 定要在使用温度下进行配制,室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃~4℃。③易 吸收空气中的CO2,所以配制的缓冲液要盖严密封。④此缓冲液对某些pH电极发生 定的干扰作用,所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。 (3)有机酸缓冲液 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成,pH范围为酸性,即pH=30~60, 最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等
２０ 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制 SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为 SDS（十二烷基硫酸钠）会与 钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的 pH 范围宽； ③pH 受温度的影响小；④缓冲液稀释后 pH 变化小，如稀释十倍后 pH 的变化小于 0.1。 其缺点为：①易与常见的钙 Ca++离子、镁 Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀； ②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液 Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用 Tris 缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl 缓冲液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0 配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别 配制 0.05mol/L Tris 和 0.05mol/L HCl 溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的 稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配 1L 0.1mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液：先 称 12.11g Tris 碱溶于 950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加 4N HCl，用 pH 计测 定溶液 pH 值至所需的 pH 值，然后再加水补足到 1L。 Tris-HCl 缓冲液的优点是： ①因为 Tris 碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲 体系配制 pH 范围由酸性到碱性的大范围 pH 值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小， 不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是：①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH 值的变化 大于 0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大，即： △pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的 pH＝8.4，则 37℃时的 pH＝7.4，所以一 定要在使用温度下进行配制，室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0℃～4℃。 ③易 吸收空气中的 CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些 pH 电极发生一 定的干扰作用，所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电极。 ⑶ 有机酸缓冲液 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0， 最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等