85%酒精5min 70%酒精5min 50%酒精5min 30%酒精5min 蒸馏水5-10min mol/L HCl的染色缸内(清洗一下) 温浴至60℃的1 mol/L HCI溶液中水解8min 取出标本,放入室温1 mol/L HCI溶液 (注意:这个步骤非常重要,必须用1moⅥ稀盐酸冲洗,因为它可以洗去贴在切片上的试剂的 痕迹。如用蒸馏水冲洗,则试剂本身也可以水解,所释放出的碱性品红,可以使切片内一切嗜碱 性物质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚,可延长其水解时间,而且毎次均需更换洗涤剂) 蒸馏水冲洗3次(使水解停止) Schf试剂中染色40min 用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料) 流水冲洗5min 蒸馏水洗片刻 1%亮绿复染数秒钟 注意:复染时间切忌过长,以免染色过深,影响对DNA的观察) 水洗脱水封片
↓ 85%酒精 5min ↓ 70%酒精 5min ↓ 50%酒精 5min ↓ 30%酒精 5min ↓ 蒸馏水 5-10min ↓ 1 mol/L HCl 的染色缸内（清洗一下） ↓ 温浴至 60℃的 1 mol/L HCl 溶液中水解 8 min ↓ 取出标本，放入室温 1 mol/L HCl 溶液 （注意: 这个步骤非常重要，必须用 1 mol/L 稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的 痕迹。如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱 性物质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂） ↓ 蒸馏水冲洗 3 次（使水解停止） ↓ Schiff 试剂中染色 40min ↓ 用亚硫酸水洗 3~5 次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料) ↓ 流水冲洗 5 min ↓ 蒸馏水洗片刻 ↓ 1%亮绿复染数秒钟 （注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对 DNA 的观察） ↓ 水洗脱水封片
实验结果 细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应,它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况 而且还可从颜色反应的深浅,来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色,核仁通 常为负反应:但在有些材料的细胞质中,DNA也会出现阳性反应 作 业 1.绘图表示 Feulgen反应的染色结果,并验交 Feulgen反应的永久切片1张 2.总结 Feulgen反应染色结果的影响因素 思考题 1. Feulgen反应的实验原理是什么? 答:DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化 合物,从而显示出DNA的分布。 2.在稀盐酸水解后,为什么要用亚硫酸水进行洗片? 答:亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸,从而可以将用 schiff剂染色时所残留 的碱性品红反应掉,以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料 I附 Feulgen方法应注意的几个问题: 1.对照切片的制做 进行 Feulgen反应时,一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放 在schi剂内,且应为负反应。但需要注意的是,对照切片在sch试剂中最多不要超过h0.5 h即可),时间过长,试剂本身的酸性也会使DNA水解,从而出现假的正反应。 2.固定剂的选择 以前很多人认为,选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的 固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明,一切好的组织学固定剂均适用于 Feulgen反应 如 Champy固定剂、Hel固定剂、 Flemming固定剂、OO固定剂、 Camoy固定剂、 zenker固 定剂和Boun-Aler固定剂。 但在上述固定剂中,以OsO4和 Carnoy效果较好,OsO(1%或0.5%)是 Feu lgen反应的理想 固定剂,只是因OsO4价钱较贵,故一般多采用 Carnoy固定液。在 Feulgen反应中,不能单独使 用Boui定液,因为它是 Feulgen反应的最坏固定剂,但经Aler改进后的 Bouin-Allr固定液效 果却较好。 3.水解时间 意人ulmn反应通常用稀酸进行水解,但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,反应就会 如水解时间过长。或水解地过于剧烈,则脱氧核糖也易掉下来,反应也会减弱。适当的水 解时间一般为8-12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸 的浓度而定 4 Schiff i试剂的作用 Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素,就是 schiff试剂的质量。有一大类试剂均称
实 验 结 果 细胞核中的 DNA 呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出 DNA 存在的部位及其分布情况， 而且还可从颜色反应的深浅，来判断 DNA 的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通 常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA 也会出现阳性反应。 作 业 1. 绘图表示 Feulgen 反应的染色结果, 并验交 Feulgen 反应的永久切片 1 张。 2. 总结 Feulgen 反应染色结果的影响因素。 思 考 题 1. Feulgen 反应的实验原理是什么？ 答：DNA 经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化 合物，从而显示出 DNA 的分布。 2. 在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？ 答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用 schiff 剂染色时所残留 的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。 [ 附 ] Feulgen 方法应注意的几个问题： 1. 对照切片的制做 进行 Feulgen 反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放 在 schiff 剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在 schiff 试剂中最多不要超过 1 h (0.5 h 即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使 DNA 水解，从而出现假的正反应。 2. 固定剂的选择 以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的 固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于 Feulgen 反应。 如 Bhampy 固定剂、Helly 固定剂、Flemming 固定剂、OsO4 固定剂、Carnoy 固定剂、zenker 固 定剂和 Bouin-Aller 固定剂。 但在上述固定剂中，以 OsO4 和 Carnoy 效果较好，OsO4(1%或 0.5%)是 Feulgen 反应的理想 固定剂，只是因 OsO4 价钱较贵，故一般多采用 Carnoy 固定液。在 Feulgen 反应中，不能单独使 用 Bouin 定液，因为它是 Feulgen 反应的最坏固定剂，但经 Aller 改进后的 Bouin-Aller 固定液效 果却较好。 3. 水解时间 Feulgen 反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会 变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水 解时间一般为 8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸 的浓度而定。 4. Schiff 试剂的作用 Feulgen 反应成功与否的一个非常关键的因素，就是 schiff 试剂的质量。有一大类试剂均称
为碱性品红,它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的 碱性品红才行。此外, Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应
为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA 染色反应用”的 碱性品红才行。此外，Schiff 试剂的配制方法也可影响 DNA 的染色反应
实验三染色体的标本制作及其组型实验 长期以来,在真核生物中,染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种 分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质DNA的载体,对生物的遗传、变异、进化和个 体发生,以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细 胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒 位置,以至带型有序地排列起来,此模式图象排列即为核型( karyotype或染色体组型。核型 分析均是以中期染色体为标准,对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象, 并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴( Joe Hin Tjio)和瑞典学者 A Levan合作,利用低渗法 研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法,终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46 条,而不是前人所主张的48条,这为后来的人类核型研究奠定了基础。 实验目的 1.通过实验,初步掌握染色体标本的制做方法,进一步了解各操作步骤的原理 2.通过组型实验,掌握染色体组型的基本方法 实验原理 自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素( phytohemagglutinin,PHA)处理后处于分 裂状态的组织或细胞,均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中,精巢和骨髓均 为是活跃分裂的组织,可不经PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面,精巢又 比骨髓要简易一些,故本实验选用小鼠的精巢为实验材料 对于小鼠精巢染色体标本的制作,一般包括以下几个要点:1.用一定剂量的秋水仙素破 坏纺锤丝的形成,使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处;2.用低渗法使将 细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上;3.空气干燥法 可使使细胞的染色体在载片上展平,经Gmsa染色后便可观察到染色体的显微图象 染色体组型又名核型,是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照 所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图,它代表了一个个体或物种的染色体特 征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数:1.相对长度( relative length):指单个染色体的 长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比,相对长度=单条染色体的长度/(单倍 体常染色体+X染色体)的总长度×100%。2.臂指数( arm index):指染色体长臂与短臂的比 率,臂指数=长臂/短臂。3.着丝粒指数( centromere index):指短臂占整个染色体长度的比率, 着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%,该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4. 染色体的臂数:对于端部着丝粒染色体,臂数为1,其它为2。根据 Levan(1964)所制定的人 类染色体标准,臂指数在1.0~-1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体,在1.7-3.0之间为亚 中央着丝粒染色体,在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体,大于70为端部着丝粒染色体 着丝粒指数在50.0~375之间的染色体为中央着丝粒染色体,在37.5250之间为亚中央着 丝粒染色体,在250~12.5之间为亚端部着丝粒染色体,小于12.5为端部着丝粒染色体
实验三 染色体的标本制作及其组型实验 长期以来，在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种 分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA 的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个 体发生, 以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细 胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒 位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型(karyotype)或染色体组型。核型 分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象， 并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者 A.Levan 合作, 利用低渗法 研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在 1956 年首次确定了人类的染色体数目是 46 条，而不是前人所主张的 48 条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。 实 验 目 的 1. 通过实验，初步掌握染色体标本的制做方法，进一步了解各操作步骤的原理 2. 通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法 实 验 原 理 自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)处理后处于分 裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均 为是活跃分裂的组织，可不经 PHA 处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又 比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。 对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破 坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将 细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法 可使使细胞的染色体在载片上展平, 经 Giemsa 染色后便可观察到染色体的显微图象。 染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照 所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特 征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数: 1. 相对长度(relative length): 指单个染色体的 长度与包括 X 染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍 体常染色体+X 染色体)的总长度×100%。2. 臂指数(arm index): 指染色体长臂与短臂的比 率，臂指数=长臂/短臂。3. 着丝粒指数(centromere index): 指短臂占整个染色体长度的比率， 着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%, 该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4. 染色体的臂数: 对于端部着丝粒染色体，臂数为 1，其它为 2。根据 Levan(1964)所制定的人 类染色体标准，臂指数在 1.0~1.7 之间的染色体为中央着丝粒染色体，在 1.7~3.0 之间为亚 中央着丝粒染色体，在 3.0~7.0 间为亚端部着丝粒染色体，大于 7.0 为端部着丝粒染色体； 着丝粒指数在 50.0~37.5 之间的染色体为中央着丝粒染色体，在 37.5~25.0 之间为亚中央着 丝粒染色体，在 25.0~12.5 之间为亚端部着丝粒染色体，小于 12.5 为端部着丝粒染色体
实验用品 材料小白鼠,蟾蜍 二、器材 普通离心机,恒温水浴,手术剪和手术镊各20把,l00ml量筒5个,滴管20支,10ml 小烧杯5个,10m刻度离心管20支,试管架5个,染色用玻璃板5块,载、盖片各20片: 显微镜20台,香柏油5瓶,擦镜纸5本,直尺20把,复印的染色体标本图20页。 试剂 秋水仙素称取秋水仙素10mg加1om的注射用水,即得0.%的秋水仙素液,以此 作为原液。在使用时,需将原液稀释50倍,即取Oln原液,加49ml注射用水,稀释后 秋水仙素的浓度为20蒲/ml 2.生理盐水:哺乳动物及人类为0.9%的NaCl溶液,两栖类为0.7%的NaCl溶液。 3. Carneys固定液;甲醇冰醋酸为3:1,必须现用现配。 4. Giemsa染液的配制 吉姆萨粉( Giemsa stain) Og 甘油(AR) 66ml 甲醇(AR) 将 Giemsa粉放入研钵中,先加入少量甘油,研磨至无颗粒为止,然后再将全部甘油倒 入,放56℃温箱中h后,加入甲醇,将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0-4℃保存)。 5.磷酸缓冲液 l/15 mol/L NazHPO4·12H2O:2.39g溶于100m双蒸水中。 1/15 mol/L KH2 PO4 0.907g溶于100ml双蒸水中。 取1/15 mol/L Na2lHPO4·12H2O液80ml、1/15mol/LKH2PO4液20m混合即为pH=738 之磷酸缓冲液。 如用无水 Na2HPC4配制磷酸缓冲液,还可用以下方法配制 液 Na2HPO4 9.47g 双蒸水 1000ml 液: KH2PO4 9.06g 双蒸水 根据下表中所示比例即可配制出不同pH值的磷酸缓冲液。 表1磷酸缓冲液配制比例 值 6l.1
实 验 用 品 一、材料 小白鼠，蟾蜍 二、器材 普通离心机，恒温水浴，手术剪和手术镊各 20 把，100ml 量筒 5 个，滴管 20 支，10ml 小烧杯 5 个，10ml 刻度离心管 20 支，试管架 5 个，染色用玻璃板 5 块, 载、盖片各 20 片； 显微镜 20 台, 香柏油 5 瓶，擦镜纸 5 本，直尺 20 把，复印的染色体标本图 20 页。 三、试剂 1. 秋水仙素: 称取秋水仙素 10mg 加 10ml 的注射用水，即得 0.1%的秋水仙素液, 以此 作为原液。在使用时，需将原液稀释 50 倍，即取 0.1ml 原液，加 4.9ml 注射用水，稀释后 秋水仙素的浓度为 20 蔳/ml。 2. 生理盐水: 哺乳动物及人类为 0.9%的 NaCl 溶液，两栖类为 0.7%的 NaCl 溶液。 3. Carnoy's 固定液；甲醇:冰醋酸为 3:1, 必须现用现配。 4. Giemsa 染液的配制； 吉姆萨粉(Giemsa stain) l.0g 甘油(AR) 66ml 甲醇(AR) 66ml 将 Giemsa 粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒 入，放 56℃温箱中 2h 后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于 0~4℃保存)。 5. 磷酸缓冲液； 1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O: 2.39g 溶于 100ml 双蒸水中。 1/15 mol/L KH2PO4 0.907g 溶于 100ml 双蒸水中。 取 1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O 液 80ml、1/15 mol/L KH2PO4 液 20ml 混合即为 pH=7.38 之磷酸缓冲液。 如用无水 Na2HPO4 配制磷酸缓冲液，还可用以下方法配制； A 液: Na2HPO4 9.47g 双蒸水 1000ml B 液: KH2PO4 9.06g 双蒸水 1000ml 根据下表中所示比例即可配制出不同 pH 值的磷酸缓冲液。 表 1 磷酸缓冲液配制比例 pH 值 A 液(ml) B 液(ml) 5.8 7.8 92.2 6.0 12.0 88.0 6.4 26.5 73.5 6.6 37.5 62.5 6.8 50.0 50.0 7.0 61.1 38.9 7.2 71.5 28.5