第五章霉菌及其毒素分析 第一节产毒霉菌及霉菌毒素的筛选 、产毒莓菌的筛选 1、直接测定霉菌毒素 2、动物试验 用于筛选产毒霉菌的动物主要有小白鼠和兔子。 (1)小白鼠常用于通过口服或注射毒性试验来筛选产毒青霉菌和曲莓菌 等。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料中,培养7~14天后,60℃ 干燥48h,以杀死或抑制霉菌生长,然后制成菌料,直接饲喂小白鼠,观察小白 鼠的生长情况或死后变化。或用有机溶剂提取制成粗毒素,注射或投服,观察小 白鼠的中毒情况或死后变化 (2)兔子常用于皮肤局部刺激试验筛选镰刀菌或其它一些产生细胞毒素 的幂菌。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料或其它基质中,培养7 14天后,用有机溶剂提取制成粗毒素,将兔子背部毛剪净,涂搽粗毒素,观察 兔子皮肤的毒性反应,如红肿、热痛、坏死等。 二、莓菌毒素的筛选和测定 霉菌毒素的发现通常有两种途径 (1)在研究自然发生中毒过程中发现霉菌毒素,如黄曲霉毒素; (2)在直接硏究某种霉菌的产毒性能时发现毒素,如硏究赭曲霉时发现赭 曲霉毒素。 引起急性中毒的毒素易为人们发现和重视。但在多数情况下,引起慢性中 毒如引起生产性能下降,对疾病的抵抗力降低等的霉菌毒素往往容易被人们忽 视。所以,筛选及测定霉菌毒素对知道畜牧业生产、防病治病有重要的意义 霉菌毒素的筛选和测定方法主要有: ()物理化学法 物理化学方法是利用气相色谱、高效液相色谱、薄层层析进行定量测定
1 第五章 霉菌及其毒素分析 第一节 产毒霉菌及霉菌毒素的筛选 一、产毒霉菌的筛选 1、直接测定霉菌毒素。 2、动物试验 用于筛选产毒霉菌的动物主要有小白鼠和兔子。 ⑴ 小白鼠 常用于通过口服或注射毒性试验来筛选产毒青霉菌和曲霉菌 等。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料中，培养 7～14 天后，60℃ 干燥 48h，以杀死或抑制霉菌生长，然后制成菌料，直接饲喂小白鼠，观察小白 鼠的生长情况或死后变化。或用有机溶剂提取制成粗毒素，注射或投服，观察小 白鼠的中毒情况或死后变化。 ⑵ 兔子 常用于皮肤局部刺激试验筛选镰刀菌或其它一些产生细胞毒素 的霉菌。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料或其它基质中，培养 7～ 14 天后，用有机溶剂提取制成粗毒素，将兔子背部毛剪净，涂搽粗毒素，观察 兔子皮肤的毒性反应，如红肿、热痛、坏死等。 二、霉菌毒素的筛选和测定 霉菌毒素的发现通常有两种途径： ⑴ 在研究自然发生中毒过程中发现霉菌毒素，如黄曲霉毒素； ⑵ 在直接研究某种霉菌的产毒性能时发现毒素，如研究赭曲霉时发现赭 曲霉毒素。 引起急性中毒的毒素易为人们发现和重视。但在多数情况下，引起慢性中 毒如引起生产性能下降，对疾病的抵抗力降低等的霉菌毒素往往容易被人们忽 视。所以，筛选及测定霉菌毒素对知道畜牧业生产、防病治病有重要的意义。 霉菌毒素的筛选和测定方法主要有： ㈠ 物理化学法 物理化学方法是利用气相色谱、高效液相色谱、薄层层析进行定量测定
这里主要就霉菌毒素的薄层层析分析作一介绍 1、采样 由于霉菌毒素一般污染饲料的胚部,因而常规的随机抽样和分层定点采样 方法有时不能代表成批饲料的真实情况。 Cucullu等曾对2Kg花生样品进行逐粒 观察,挑出其中20粒霉变花生,发现这些花生的黄曲霉毒素含量在0.3ppm至 1100之间。即使样品中霉变花生比例变化很小,其结果也将发生很大的变化。所 以,进行霉菌毒素分析时,其采集平均试样的采样点要比常规采样多。散装样品, 需采100个点以上,袋装样品要采25%以上袋。平均试样经过粉碎后再缩分成试 样,供测定用。 推荐的饿米军毒素的采样过程: 100个点以上 粉碎 匀浆 大批样品 3×3.5Kg(平均试样)——3×350g—3×2×100g。 25%袋以上 缩分 缩分 2、提取 霉菌毒素通常均为有机物,须用响应极性的有机溶剂提取。 常用有机溶剂: 粗提溶剂一一甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈,这些溶剂单独使用或 两种、两种以上配合使用 纯化用溶剂(萃取)一一石油醚,正己烷 常用的提取方法:振荡提取30~45min; 高速匀浆提取3min。 3、纯化 霉菌毒素提取液的怀春化除了前述的萃取法、柱层析法和薄层色谱法外, 还有液固提取法( Liquid- solid extractrion)和化学吸附法( Chemical absorption) 液固提取法是利用多数霉菌毒素不溶于石油醚和正己烷的性质,用正己烷 或石油醚除去试样中的脂肪、色素等弱极性杂质的一种纯化方法。此法常在试样 提取前或与提取同时进行。 2
2 这里主要就霉菌毒素的薄层层析分析作一介绍。 1、采样 由于霉菌毒素一般污染饲料的胚部，因而常规的随机抽样和分层定点采样 方法有时不能代表成批饲料的真实情况。Cucullu 等曾对 2Kg 花生样品进行逐粒 观察，挑出其中 20 粒霉变花生，发现这些花生的黄曲霉毒素含量在 0.3ppm 至 1100 之间。即使样品中霉变花生比例变化很小，其结果也将发生很大的变化。所 以，进行霉菌毒素分析时，其采集平均试样的采样点要比常规采样多。散装样品， 需采 100 个点以上，袋装样品要采 25%以上袋。平均试样经过粉碎后再缩分成试 样，供测定用。 推荐的饿米军毒素的采样过程： 100 个点以上 粉碎 匀浆 大批样品————3×3.5Kg（平均试样）——3×350g——3×2×100g。 25%袋以上 缩分 缩分 2、提取 霉菌毒素通常均为有机物，须用响应极性的有机溶剂提取。 常用有机溶剂： 粗提溶剂——甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，这些溶剂单独使用或 两种、两种以上配合使用。 纯化用溶剂（萃取）——石油醚，正己烷。 常用的提取方法：振荡提取 30～45min； 高速匀浆提取 3min。 3、纯化 霉菌毒素提取液的怀春化除了前述的萃取法、柱层析法和薄层色谱法外， 还有液固提取法（Liquid-solid extractrion）和化学吸附法(Chemical absorption)。 液固提取法是利用多数霉菌毒素不溶于石油醚和正己烷的性质，用正己烷 或石油醚除去试样中的脂肪、色素等弱极性杂质的一种纯化方法。此法常在试样 提取前或与提取同时进行
化学吸附法是吸附柱色谱的衍化,系用一些吸附剂如硅藻土、硅胶、活性 炭、碳酸铜等将杂质吸附除去的一种方法,此法常与试样提取冋时进行。 4、测定 下表所列的是几种霉菌毒素TLC进行测定的方法。 表5-1几种霉菌毒素TLC分析方法 毒素名称吸附剂 展开剂 Rf|显色方法 氯仿一甲醇(97:3) 黄曲霉毒素B1硅胶氯仿一丙酮一正己烷(7:2:1)035Uvy5m 氯仿一丙酮(9:1) 0.27 硅胶+草 氯仿一甲醇(98:2) 桔青霉素 0.51 UV365nm 酸 氯仿一丙酮(9:1) 赭曲霉毒素A硅胶 苯一乙酸(4:1) 0.40UV365nm 苯一甲醇(97:3) 展青霉素 硅胶 苯一丙酮(9:1) 0.16 UV254nm 氯仿一甲醇(97:3) 0.67 杂色曲霉毒素硅胶 UV254nm 氯仿一丙酮(9:1) 仿一甲醇(97:3) 0.45 T2毒素 硅胶 硫酸铈 氯仿一丙酮(9:1) 0.22 氯仿一甲醇(97:3) 玉米赤霉烯酮 硅胶 氯仿一丙酮(9:1) 0.38 UV254nm 氯仿一甲醇(97:3) 0.40 震颤素 硅胶|氯仿一丙酮一正己烷(7:2:1)051硫酸铈加热 3
3 化学吸附法是吸附柱色谱的衍化，系用一些吸附剂如硅藻土、硅胶、活性 炭、碳酸铜等将杂质吸附除去的一种方法，此法常与试样提取同时进行。 4、测定 下表所列的是几种霉菌毒素 TLC 进行测定的方法。 表 5-1 几种霉菌毒素 TLC 分析方法 毒素名称 吸附剂 展开剂 Rf 显色方法 黄曲霉毒素 B1 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.44 0.35 0.27 UV365nm 桔青霉素 硅胶+草 酸 氯仿—甲醇（98﹕2） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.52 0.51 UV365nm 赭曲霉毒素 A 硅胶 苯—乙酸（4﹕1） 0.40 UV365nm 展青霉素 硅胶 苯—甲醇（97﹕3） 苯—丙酮（9﹕1） 0.22 0.16 UV254nm 杂色曲霉毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.67 0.27 UV254nm T-2 毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.45 0.22 硫酸铈 玉米赤霉烯酮 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.40 0.38 UV254nm 震颤素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 0.40 0.51 UV254nm 硫酸铈加热
白生物学试验 生物学试验方法主要包括细胞学试验、微生物学试验、免疫学试验和动物试 验等。 1、细胞学实验 细胞学试验是利用某些霉菌毒素具有细胞毒性,对组织培养细胞具有毒性作 用,引起细胞变形、细胞数减少,形成巨细胞或引起细胞死亡等 用来做细胞学试验的组织细胞有:1日龄小鸡气管细胞:小牛肾细胞和鸡胚 细胞等 2、微生物学试验 许多霉菌毒素起初都是作为抗菌素被发现的。微生物学实验就是利用某些霉 菌毒素的抑菌性能来测定其毒性。 常用的微生物有:巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium)、枯草杆菌(B. Su- bilis)、乳酸菌( Lactic acid bactria)。 由于不同霉菌毒素对不同动物、不同组织细胞的毒性不同,因此在结果分析 时应注意:微生物学试验不可能测定所有对脊椎动物有毒的毒素,特别是侵害脊 椎动物神经系统的毒素。同时,抑菌试验结果理想的毒素也不一定对脊椎动物有 毒性 3、免疫学试验 免疫学试验是测定霉菌毒素的高特异性和髙灵敏度的定性定量方法。目日前已 用于测定赭曲霉毒素A、T-2毒素、黄曲霉毒素B1和M、玉米赤霉烯酮等。 免疫学试验包括放射免疫试验和酶联免疫吸附试验。 (1)放射免疫试验( Radioimmunoassay,RIA) 放射免疫试验是将同位素技术的高灵敏与抗原抗体反映的高特异性结合起 来。其基本原理是放射性标记抗原与非标记抗原竞争性地和抗体结合,当样品中 的非标记抗原的量增加时,标记抗原与抗体形成的复合物的两减少,即样品中待 测抗原的量与标记抗原抗体复合物的量成反比。所以可根据标记抗原抗体复合物 的多少(放射性强度)来定量未知抗原
4 ㈡ 生物学试验 生物学试验方法主要包括细胞学试验、微生物学试验、免疫学试验和动物试 验等。 1、细胞学实验 细胞学试验是利用某些霉菌毒素具有细胞毒性，对组织培养细胞具有毒性作 用，引起细胞变形、细胞数减少，形成巨细胞或引起细胞死亡等。 用来做细胞学试验的组织细胞有：1 日龄小鸡气管细胞；小牛肾细胞和鸡胚 细胞等。 2、微生物学试验 许多霉菌毒素起初都是作为抗菌素被发现的。微生物学实验就是利用某些霉 菌毒素的抑菌性能来测定其毒性。 常用的微生物有：巨大芽孢杆菌（Bacillus negaterium）、枯草杆菌(B. Su-btilis)、乳酸菌(Lactic acid bactria)。 由于不同霉菌毒素对不同动物、不同组织细胞的毒性不同，因此在结果分析 时应注意：微生物学试验不可能测定所有对脊椎动物有毒的毒素，特别是侵害脊 椎动物神经系统的毒素。同时，抑菌试验结果理想的毒素也不一定对脊椎动物有 毒性。 3、免疫学试验 免疫学试验是测定霉菌毒素的高特异性和高灵敏度的定性定量方法。目前已 用于测定赭曲霉毒素 A、T-2 毒素、黄曲霉毒素 B1 和 M1、玉米赤霉烯酮等。 免疫学试验包括放射免疫试验和酶联免疫吸附试验。 ⑴ 放射免疫试验（Radioimmunoassay, RIA） 放射免疫试验是将同位素技术的高灵敏与抗原抗体反映的高特异性结合起 来。其基本原理是放射性标记抗原与非标记抗原竞争性地和抗体结合，当样品中 的非标记抗原的量增加时，标记抗原与抗体形成的复合物的两减少，即样品中待 测抗原的量与标记抗原抗体复合物的量成反比。所以可根据标记抗原抗体复合物 的多少（放射性强度）来定量未知抗原
(2)酶联免疫吸附试验( Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) 酶联免疫吸附试验的基本原理是酶标记抗原或抗体与相应的抗体或抗原后, 结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物,催化底物水解、氧化或还原,产生有 色物质,颜色的深浅与相应抗原或抗体的量成正比,借助颜色的深浅来定量抗原 或抗体 注意:霉菌毒素是一类半抗原,它们不能单独刺激机体产生抗体,必须将它 们和载体(如丙种球蛋白、卵清蛋白等)结合后,才具免疫原性。 4、动物试验 动物试验在霉菌毒素筛选中用得较多的有雏鸭试验和小白鼠子宫增重试验。 雏鸭试验用于黄曲霉毒素筛选。雏鸭对黄曲霉毒素特别敏感,当用含黄曲霉 毒素的饲料饲喂雏鸭或用其粗提取液注射时,可引起雏鸭死亡,并出现特征性的 病理组织学变化—一胆小管增生 小白鼠子宫増重试验用于玉米赤霉烯酮的筛选。玉米赤霉烯酮具有雌激素样 作用,当用含玉米赤霉烯酮的饲料饲喂小白鼠或用粗提取液注射时,可引起小白 鼠的子宫增大。 第二节饲料中常见产毒霉菌属的鉴定 霉菌的鉴定,是在于确定一种未知菌的分类地位和属名、种名。其鉴定的主 要依据是形态特征和培养性状 培养条件 由于霉菌在不同的培养条件下形态有所不同,所以在鉴定霉菌时,需要用固 定的培养条件。这些条件包括:特定的培养基、一定的培养温度和培养时间。 通常鉴定青霉和曲霉的标准培养基为察氏培养基,以麦牙汁琼脂培养基作为 辅助培养基。培养温度为23~25℃;培养时间:3~5天时进行显微观察,7~14 天时进行莓菌的形态特征观察
5 ⑵ 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA） 酶联免疫吸附试验的基本原理是酶标记抗原或抗体与相应的抗体或抗原后， 结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物，催化底物水解、氧化或还原，产生有 色物质，颜色的深浅与相应抗原或抗体的量成正比，借助颜色的深浅来定量抗原 或抗体。 注意：霉菌毒素是一类半抗原，它们不能单独刺激机体产生抗体，必须将它 们和载体（如丙种球蛋白、卵清蛋白等）结合后，才具免疫原性。 ４、动物试验 动物试验在霉菌毒素筛选中用得较多的有雏鸭试验和小白鼠子宫增重试验。 雏鸭试验用于黄曲霉毒素筛选。雏鸭对黄曲霉毒素特别敏感，当用含黄曲霉 毒素的饲料饲喂雏鸭或用其粗提取液注射时，可引起雏鸭死亡，并出现特征性的 病理组织学变化——胆小管增生。 小白鼠子宫增重试验用于玉米赤霉烯酮的筛选。玉米赤霉烯酮具有雌激素样 作用，当用含玉米赤霉烯酮的饲料饲喂小白鼠或用粗提取液注射时，可引起小白 鼠的子宫增大。 第二节 饲料中常见产毒霉菌属的鉴定 霉菌的鉴定，是在于确定一种未知菌的分类地位和属名、种名。其鉴定的主 要依据是形态特征和培养性状。 一、培养条件 由于霉菌在不同的培养条件下形态有所不同，所以在鉴定霉菌时，需要用固 定的培养条件。这些条件包括：特定的培养基、一定的培养温度和培养时间。 通常鉴定青霉和曲霉的标准培养基为察氏培养基，以麦牙汁琼脂培养基作为 辅助培养基。培养温度为 23～25℃；培养时间：3～5 天时进行显微观察，7～14 天时进行霉菌的形态特征观察