第三章饲料卫生检验常用分析方法 对饲料中的有毒有害物质进行定性定量分析是饲料卫生检验的内容之一。由 于检验的目的、被检测物质的性质以及它们在饲料中的含量不同,所选用的方法 也各不相同。在饲料卫生检验中,应用最多的是薄层层析法、分光光度法、气相 色谱法、液相色谱法以及荧光分析法等 第一节饲料卫生检验常用分析方法 气相色谱法 气相色谱法( Gas chromatography,GC)是以气体作为流动相对混合组分进 行分离分析的一种色谱方法。 此法特别适用于分子量小于300,加热有一定挥发性物质的分析。目前,多 种真菌毒素、有机磷农药、有机氯农药的气相色谱分析已有报道 二、高效液相色谱法 高效液相色谱法( High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是利用高 压输送的液体作为流动相的一种色谱方法。 高效液相色谱仪由于采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具有 髙压、高髙速、髙效和髙灵敏度等优点。HPLC是将样品制成溶液进样,不经过气 化,所以不受样品挥发性的约束。故尤其适用于一些挥发性低、热稳定性差、分 子量较大的高分子化合物及离子型化合物的分离分析。在饲料卫生检验中,此法 已用于苯并(a)芘、黄曲霉毒素、有机磷农药以及有机氯农药等分析。 三、薄层色谱法 薄层层析法( Thin Layer Chromatography,∏C)是将固定相均匀地涂布于玻 板上制成薄层,以液体作为流动相,对混合组分进行分离、定性、定量的一种方 法。薄层层析法是一种经典色谱方法,由于它具有不需要仼何仪器设备,操作简 第1页共17页
第 1 页 共 17页 - - 第三章 饲料卫生检验常用分析方法 对饲料中的有毒有害物质进行定性定量分析是饲料卫生检验的内容之一。由 于检验的目的、被检测物质的性质以及它们在饲料中的含量不同，所选用的方法 也各不相同。在饲料卫生检验中，应用最多的是薄层层析法、分光光度法、气相 色谱法、液相色谱法以及荧光分析法等。 第一节 饲料卫生检验常用分析方法 一、气相色谱法 气相色谱法（Gas chromatography，GC）是以气体作为流动相对混合组分进 行分离分析的一种色谱方法。 此法特别适用于分子量小于 300，加热有一定挥发性物质的分析。目前，多 种真菌毒素、有机磷农药、有机氯农药的气相色谱分析已有报道。 二、高效液相色谱法 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是利用高 压输送的液体作为流动相的一种色谱方法。 高效液相色谱仪由于采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具有 高压、高速、高效和高灵敏度等优点。HPLC 是将样品制成溶液进样，不经过气 化，所以不受样品挥发性的约束。故尤其适用于一些挥发性低、热稳定性差、分 子量较大的高分子化合物及离子型化合物的分离分析。在饲料卫生检验中，此法 已用于苯并（a）芘、黄曲霉毒素、有机磷农药以及有机氯农药等分析。 三、薄层色谱法 薄层层析法（Thin Layer Chromatography, TLC）是将固定相均匀地涂布于玻 板上制成薄层，以液体作为流动相，对混合组分进行分离、定性、定量的一种方 法。薄层层析法是一种经典色谱方法，由于它具有不需要任何仪器设备，操作简
便、快速、灵敏度髙、分离效果好等优点,因而在饲料毒物分析中应用十分广泛 四、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法( Atomic Absorptive Spectrometer, AAS)利用待测元素 的基态原子蒸汽对特定波长的谱线光有吸收作用,根据特征性谱线光被吸收的程 度来测定试样中待测元素含量的方法。 AAS是测定进素元素含量的重要手段之一。本法具有选择性好(通常情况下 共存元素不产生干扰,试样不需纯化)、灵敏度高(可达ppm,甚至ppb)、重现性 好、分析速度快等优点。因而被作为饲料卫生检验的标准方法之 缺点:对不同的分析项目,其测定条件不同,特别是要求具有不同的光源灯。 另外,仪器昂贵,因此,其应用面和程度受到限制。 五、紫外可见分光光度法 Visible and Ultraviolet Absorption Spectrum) 根据朗—一比耳定律,当一束平行的单色光通过某一种均匀透明的稀溶液 时,溶液的吸光度(或称光密度)等于吸光系数乘以溶液的厚度乘以溶液的浓度, 即A=K×C×L,K表示某种物质溶液对某特定波长光的吸收能力,与溶液的浓度 及厚度无关。紫外一可见光光度仪即根据这一原理,用棱镜或光栅将光源的光线 分成单色光,用一定厚度的液槽(或称比色杯,常是0.5cm、lcm、2cm、5cm), 通过比较待测液与标准溶液的吸光度,求出待测溶液的浓度 紫外光源用于测定具有共轭双键结构的无色物质;可见光源用于测定一般 的有色物质。 本法灵敏度高,操作简便,快速,廉价,因而在饲料卫生检验上应用很广。 近年来又出现了双波长分光光度法( Dualwavelength Spectrophotometry)。 这是一种新技术,不用参比液,而是选用两种不同的波长,A1与A2的光束通过 一个样品,测定在这两种波长下的吸收度差值其中λ1下的吸收度为参比吸收度, λ2下的吸收度为测量吸收度。此法最突出的优越性是不仅对吸收光谱互相重叠的 第2页共17页
第 2 页 共 17页 - - 便、快速、灵敏度高、分离效果好等优点，因而在饲料毒物分析中应用十分广泛。 四、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法（Atomic Absorptive Spectrometer,AAS）利用待测元素 的基态原子蒸汽对特定波长的谱线光有吸收作用，根据特征性谱线光被吸收的程 度来测定试样中待测元素含量的方法。 AAS 是测定进素元素含量的重要手段之一。本法具有选择性好（通常情况下 共存元素不产生干扰，试样不需纯化）、灵敏度高（可达 ppm,甚至 ppb）、重现性 好、分析速度快等优点。因而被作为饲料卫生检验的标准方法之一。 缺点：对不同的分析项目，其测定条件不同，特别是要求具有不同的光源灯。 另外，仪器昂贵，因此，其应用面和程度受到限制。 五、紫外—可见分光光度法 （Visible and Ultraviolet Absorption Spectrum） 根据朗——比耳定律，当一束平行的单色光通过某一种均匀透明的稀溶液 时，溶液的吸光度（或称光密度）等于吸光系数乘以溶液的厚度乘以溶液的浓度， 即 A=K×C×L，K 表示某种物质溶液对某特定波长光的吸收能力,与溶液的浓度 及厚度无关。紫外—可见光光度仪即根据这一原理，用棱镜或光栅将光源的光线 分成单色光，用一定厚度的液槽（或称比色杯，常是 0.5cm、1cm、2cm、5cm）， 通过比较待测液与标准溶液的吸光度，求出待测溶液的浓度。 紫外光源用于测定具有共轭双键结构的无色物质；可见光源用于测定一般 的有色物质。 本法灵敏度高，操作简便，快速，廉价，因而在饲料卫生检验上应用很广。 近年来又出现了双波长分光光度法（Dualwavelength Spectrophotometry）。 这是一种新技术，不用参比液，而是选用两种不同的波长，λ1 与λ2 的光束通过 一个样品,测定在这两种波长下的吸收度差值,其中λ1 下的吸收度为参比吸收度, λ2 下的吸收度为测量吸收度。此法最突出的优越性是不仅对吸收光谱互相重叠的
混合样品可以不经分离直接测定,而且可以测定混浊样品。 六、荧光分析法 荧光分析法( Fluorescence analysis)是利用某些物质的分子能吸收能量而 发射出荧光,根据荧光的光谱和强度,对物质进行定性或定量的方法。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样用量少、方法简便和能提供较多 的理论参数等优点,它的测定下限通常比分光光度法低2-4个数量,其检出限可 达ppb乃至ppt级。在饲料卫生检验中,常用于黄曲霉素、苯并(a)芘、铅等物 质的测定。但从总的来说,由于能产生荧光的物质不是很多,故应用范围不如分 光光度法 七、离子选择电极法 根据电化学原理,在一个由参比电极和某种特定电极(离子选择性电极如 氟电极等)组成原电池中,原电池的电位与溶液中该离子的活度之对数成正比 2.303RT E=E0± 式中:E为原电池的电极电位 Eo为常数项取决于参比电极和溶液的离子活度; R为气体常数即8315焦耳/度 T为绝对温度即273+t℃ 为法拉第常数,96500库仑 n为待测离子的价数; 2.303RT nF 为该直线在一定温度下的理论斜率 α为待测溶液中某离子的活度,在稀溶液中,离子浓度就是该离子的活度。 离子选择电极法就是根据以上原理,通过测定原电池电位的变化,来对被测 定溶液中某离子的浓度进行定量的一种分析方法。本法操作极为简便,灵敏度较 高,且样品不需作复杂的处理。但本法尚有一些缺点,主要是精度差,重现性不 第3页共17页
第 3 页 共 17页 - - 混合样品可以不经分离直接测定，而且可以测定混浊样品。 六、荧光分析法 荧光分析法（Fluorescence analysis）是利用某些物质的分子能吸收能量而 发射出荧光，根据荧光的光谱和强度，对物质进行定性或定量的方法。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样用量少、方法简便和能提供较多 的理论参数等优点，它的测定下限通常比分光光度法低 2~4 个数量，其检出限可 达 ppb 乃至 ppt 级。在饲料卫生检验中，常用于黄曲霉素、苯并（a）芘、铅等物 质的测定。但从总的来说，由于能产生荧光的物质不是很多，故应用范围不如分 光光度法。 七、离子选择电极法 根据电化学原理，在一个由参比电极和某种特定电极（离子选择性电极如 氟电极等）组成原电池中，原电池的电位与溶液中该离子的活度之对数成正比： 即 E=E0± 2.303RT nF lgα 式中：E 为原电池的电极电位； E0 为常数项,取决于参比电极和溶液的离子活度； R 为气体常数,即 8.315 焦耳/度； T 为绝对温度,即 273+t℃； F 为法拉第常数,96500 库仑； n 为待测离子的价数； 2.303RT nF 为该直线在一定温度下的理论斜率 α为待测溶液中某离子的活度,在稀溶液中,离子浓度就是该离子的活度。 离子选择电极法就是根据以上原理，通过测定原电池电位的变化，来对被测 定溶液中某离子的浓度进行定量的一种分析方法。本法操作极为简便，灵敏度较 高，且样品不需作复杂的处理。但本法尚有一些缺点，主要是精度差，重现性不
好,需进一步完善。目前离子选择电极的品种很多,有K、Na、Ca、F、NO,、 So2等。在食品卫生检验中作为标准的分析方法是氟离子选择电极法 八、放射免疫测定法 放射免疫测定法( Radio Immuno Assay RIA)是一种将放射性同位素测量和 免疫反应原理相结合的同位素体外检测法。 RIA的基本原理是利用标记抗原(Ag*)与未知抗原(Ag)和特异性抗体(Ab) 间发生竞争作用来测定抗原(毒物或药物)的浓度。 因免疫反应的本质是抗原抗体反应,形成抗原抗体复合物。放射性同位素与 抗原相结合形成标记抗原,与其相应的特异性抗体产生抗原抗体反应。 Ag(未标记抗原) AgAb(未标记抗原抗体复合物) +ab Ag*(标记抗原) Ag*Ab(标记抗原抗体复合物) “未结合状态” “结合状态” (Free) (Bound 在上述免疫反疫中Ab对Ag*与Ag之间没有选择性,具的相同的亲和力, 结合的机会相等。这就是说未标记抗原遇到特异抗体要发生抗原抗体反应,生成 抗原抗体复物。标记抗原遇到特异性抗体也会发生抗原抗体反应,形成标记抗原 抗体复合物。所以说标记抗原(Ag*)及未标记抗原(Ag)与特异性抗体间发生 竞争作用( Competitive reaction)。因此,如果我们将要测定的抗原先进行标记 然后将一定量的标记抗原(Ag*),一定量的抗体(Ab)与未标记的抗原(Ag 待测毒物)相混合,则无论是Ag*或Ag都要与Ab发生竞争作用而形成竞争结合。 如未标记抗原浓度增大,则Ag*Ab复合物浓度就减少。因Ag*对Ab的结合被 Ag的竞争所抑制;反之如未标记的抗原浓度减少,则Ag*Ab复合物的浓度就增 大。因而在一定量标记抗原,一定稀释度的抗体与待测的未知量抗原作用一定时 间后,用放射性同位素的方法来测量标记抗菌素原抗体复合物的放射性,即可测 第4页共17页
第 4 页 共 17页 - - 好，需进一步完善。目前离子选择电极的品种很多，有 K、Na、Ca、F、NO- 3 、 SO2- 4 等。在食品卫生检验中作为标准的分析方法是氟离子选择电极法。 八、放射免疫测定法 放射免疫测定法（Radio Immuno Assay RIA）是一种将放射性同位素测量和 免疫反应原理相结合的同位素体外检测法。 RIA 的基本原理是利用标记抗原（Ag*）与未知抗原（Ag）和特异性抗体（Ab） 间发生竞争作用来测定抗原（毒物或药物）的浓度。 因免疫反应的本质是抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物。放射性同位素与 抗原相结合形成标记抗原，与其相应的特异性抗体产生抗原抗体反应。 Ag（未标记抗原） AgAb（未标记抗原抗体复合物） +Ab + Ag*（标记抗原） Ag*Ab（标记抗原抗体复合物） “未结合状态” “结合状态” （Free） （Bound） 在上述免疫反疫中 Ab 对 Ag*与 Ag 之间没有选择性，具的相同的亲和力， 结合的机会相等。这就是说未标记抗原遇到特异抗体要发生抗原抗体反应，生成 抗原抗体复物。标记抗原遇到特异性抗体也会发生抗原抗体反应，形成标记抗原 抗体复合物。所以说标记抗原（Ag*）及未标记抗原（Ag）与特异性抗体间发生 竞争作用（Compefitive reaction）。因此，如果我们将要测定的抗原先进行标记， 然后将一定量的标记抗原（Ag*），一定量的抗体（Ab）与未标记的抗原（Ag， 待测毒物）相混合，则无论是 Ag*或 Ag 都要与 Ab 发生竞争作用而形成竞争结合。 如未标记抗原浓度增大，则 Ag*Ab 复合物浓度就减少。因 Ag*对 Ab 的结合被 Ag 的竞争所抑制；反之如未标记的抗原浓度减少，则 Ag*Ab 复合物的浓度就增 大。因而在一定量标记抗原，一定稀释度的抗体与待测的未知量抗原作用一定时 间后，用放射性同位素的方法来测量标记抗菌素原抗体复合物的放射性，即可测
出毒物的含量。测定时,先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原与抗体作 用,测定各种标准浓度抗原的标记抗原抗体复合物的放射性结合率(B%),即可 绘成标准曲线。即标准竞争抑制曲线。然后取一定量样品按同法进行测定,再根 据被测抗原的放射性结合率(B%),就可从标准竞争抑制曲线中查出相应的该抗 原的含量,即预测定的毒物之含量。 RIA由于具有灵敏度高(可检测109-1012g)、特异性强、用样量少(0.1-lm) 等特点,所以应用越来越广,发展也更加迅速。其突出特点是样品可不必纯化处 理,所以应用其进行的药物与毒物的种类越来越多。目前已将RIA商品化,标准 化,成套出售RIA试剂盒以及自动化测录的同位素计数仪的配备,使RA的应用 更加方便 第二节薄层色谱法 薄层色谱法是色谱法的一个重要分支。由于该法具有设备简单、操作方便 对混合组分的分离效果好等优点,故广泛应用于饲料中农药、真菌毒素等的分离 和分析。 薄层色谱根据分离的机理不同,可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子 交换薄层色谱和凝胶过滤薄层色谱等四种。考虑在饲料卫生检验中的实际应用情 况,这里只介绍吸附薄层色谱。 吸附薄层色谱的原理 吸附薄层色谱主要是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的不同,及展开 剂对它们的解吸附能力不同,使各成分达到分离的目的。 凡具有吸附能力,能将溶液中的一些成分吸附到它表面的固体物称为吸附 剂,吸附剂的吸附活性主要由物质的表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德 华力等产生。吸附剂对各种有机化合物能表现出不同的吸附活性。用一定的溶剂 系统展开时,由于溶剂与样品组分争夺吸附剂表面,产生竞争吸附作用,因此, 产生了吸附与解吸附的过程。可见,薄层分离过程实际上是一个吸附、解吸附、 第5页共17页
第 5 页 共 17页 - - 出毒物的含量。测定时，先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原与抗体作 用，测定各种标准浓度抗原的标记抗原抗体复合物的放射性结合率（B%），即可 绘成标准曲线。即标准竞争抑制曲线。然后取一定量样品按同法进行测定，再根 据被测抗原的放射性结合率（B%），就可从标准竞争抑制曲线中查出相应的该抗 原的含量，即预测定的毒物之含量。 RIA 由于具有灵敏度高（可检测 10-9~10-12g）、特异性强、用样量少（0.1~1ml） 等特点，所以应用越来越广，发展也更加迅速。其突出特点是样品可不必纯化处 理，所以应用其进行的药物与毒物的种类越来越多。目前已将 RIA 商品化，标准 化，成套出售 RIA 试剂盒以及自动化测录的同位素计数仪的配备，使 RIA 的应用 更加方便。 第二节 薄层色谱法 薄层色谱法是色谱法的一个重要分支。由于该法具有设备简单、操作方便、 对混合组分的分离效果好等优点，故广泛应用于饲料中农药、真菌毒素等的分离 和分析。 薄层色谱根据分离的机理不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子 交换薄层色谱和凝胶过滤薄层色谱等四种。考虑在饲料卫生检验中的实际应用情 况，这里只介绍吸附薄层色谱。 一、吸附薄层色谱的原理 吸附薄层色谱主要是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的不同，及展开 剂对它们的解吸附能力不同，使各成分达到分离的目的。 凡具有吸附能力，能将溶液中的一些成分吸附到它表面的固体物称为吸附 剂，吸附剂的吸附活性主要由物质的表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德 华力等产生。吸附剂对各种有机化合物能表现出不同的吸附活性。用一定的溶剂 系统展开时，由于溶剂与样品组分争夺吸附剂表面，产生竞争吸附作用，因此， 产生了吸附与解吸附的过程。可见，薄层分离过程实际上是一个吸附、解吸附