辨率不但比光镜高出很多,而且还能显示出样品表面的立体形象。其它两种作用方式的电镜 由于与我们细胞生物学研究关系不大,在此就不再一一向大家介绍 四、电镜的操作演示与示教 1.电镜操作的演示 学生参观分两组交叉进行,一组参观透射电镜,一组参观扫描电镜,然后再交换参观内 2.电镜照片的展示 挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片,供同学们观察和学习,以 了解各种亚细胞结构的超微结构特征。 作 业 1.通过本实验的学习,比较光镜与电镜工作原理的区别。 2.区分细胞的超微结构和显微结构,写出各种示教细胞器的名称及其结构特征
辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。其它两种作用方式的电镜 由于与我们细胞生物学研究关系不大, 在此就不再一一向大家介绍了。 四、电镜的操作演示与示教 1. 电镜操作的演示 学生参观分两组交叉进行，一组参观透射电镜，一组参观扫描电镜，然后再交换参观内 容。 2. 电镜照片的展示 挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以 了解各种亚细胞结构的超微结构特征。 作 业 1. 通过本实验的学习，比较光镜与电镜工作原理的区别。 2. 区分细胞的超微结构和显微结构, 写出各种示教细胞器的名称及其结构特征
思考题 1.通过本实验的学习,比较光镜与电镜的主要异同点。 答 电子显微镜与光学显微镜的主要异同点 光学显微镜 电子显微镜 照射光 光束 电子束 波长m)|长:200750 短:0003~0008 介质 真空 电磁透镜 分辨力 0.2-0.lpm 0.1nm 放大倍数 1000 1000.000 聚焦方式 机械聚焦 电聚焦 反衬度 吸收、反射散射、吸收、衍射、相位 2.总结扫描电镜与透射电镜的主要异同点。 答:常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的 种类型,应用非常广泛,既可以用来分析生物组织的内部结构,又可以用来研究金属内部 的晶体结构;是当今世界上所用电镜中数量最多的一类,约占现有电镜总数的90%左右,扫 描电镜属于物体发射电子这一类,可以用来观察复杂的表面图像,其焦深和分辨率不但比光 镜高出很多,而且还能显示出样品表面的立体形象 [附]扫描电镜的结构与成像原理 在 Oatley等学者的努力下,于1965年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜( scanning electron microscope,SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发 射出的次级电子,由带样电荷的栅极收集后,即向电子显象管发送信号,在荧光屏上显示出 与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面 发射出次级电子,标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重 金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号,可用于电子成像 1.扫描电镜的基本结构 扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理 及显示系统,以及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中,电子枪、电磁透镜、扫描线 圈又被称为电子光学系统 其电子枪所发射电子的波长一般为1~10nm,使用的电压范围为1~10KV。扫描线圈为 扫描电镜所特有的结构,可作光栅状扫描,以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样 品室较大,样品有专用的样品托,可在样品室内进行各不同方向的平移和倾转;另外,在样 品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系统包括次级电子探测器、光电倍增管 和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成,主要作用是收集由标本表面发射出的 次级电子,并将其转变成光子:光电倍增管可将光子信号放大后,又将其转换成电压信号 而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像
思 考 题 1. 通过本实验的学习，比较光镜与电镜的主要异同点。 答： 电子显微镜与光学显微镜的主要异同点 光学显微镜 电子显微镜 照 射 光 光 束 电子束 波长(nm) 长：200~750 短：0.003~0.008 介 质 空 气 真 空 透 镜 光学透镜 电磁透镜 分 辨 力 0.2~0.1m 0.1nm 放大倍数 1,000 1,000,000 聚焦方式 机械聚焦 电聚焦 反 衬 度 吸收、反射 散射、吸收、衍射、相位 2. 总结扫描电镜与透射电镜的主要异同点。 答：常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的 一种类型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部 的晶体结构; 是当今世界上所用电镜中数量最多的一类, 约占现有电镜总数的 90%左右, 扫 描电镜属于物体发射电子这一类, 可以用来观察复杂的表面图像, 其焦深和分辨率不但比光 镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。 [ 附 ] 扫描电镜的结构与成像原理 在 Oatley 等学者的努力下，于 1965 年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发 射出的次级电子，由带样电荷的栅极收集后, 即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出 与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面 发射出次级电子，标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒, 重 金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号, 可用于电子成像。 1. 扫描电镜的基本结构 扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理 及显示系统，以及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中, 电子枪、电磁透镜、扫描线 圈又被称为电子光学系统。 其电子枪所发射电子的波长一般为 1~10nm，使用的电压范围为 1~10KV。扫描线圈为 扫描电镜所特有的结构，可作光栅状扫描，以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样 品室较大，样品有专用的样品托，可在样品室内进行各不同方向的平移和倾转；另外，在样 品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系统包括次级电子探测器、光电倍增管 和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成，主要作用是收集由标本表面发射出的 次级电子，并将其转变成光子；光电倍增管可将光子信号放大后，又将其转换成电压信号； 而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像
2.扫描电镜的成像原理 电子枪发射出的电子束,经电磁透镜会聚成极细的电子束,并进而聚焦在待测样品表面 由于样品各不同部位的表面形貌不同,入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用 后所产生的次级电子信号也不同;此次级电子信号为探测器接受后,被转变成光子,传递给 光电倍增管进行放大和转换;转换成的电压信号经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏 上 由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描,再加上显象管的偏转线圈电流与扫描 线圈电流高度同步,因此,显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的 次级电子数均是一一对应的,因此,显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。 综上所述,扫描电镜在结构和工作原理上均不同于透射电镜。如(1)扫描电镜所用样品 的制备方法简便,不需经过超薄切片,经固定、干燥和喷金后即可:(2)扫描电镜采用的是次 级电子成像;(3)扫描电镜所观察到图像景深长,图像富有立体感,但只能反映出样品的表面 形貌;(4)图像的放大倍率在很大范围内是连续可变的(101~105×)(5)样品的辐射损伤及污染 程度小等。但与透射电镜相比,扫描电镜又存在有其不可逾越的局限性,如(1)分辨率还不 够高,(2)无法显示样品内部的详细结构等。为此,近年来出现了一种新的电镜技术冰冻蚀刻 技术( (freeze etching),利用“复膜(replica)”在透射电镜下进行观察,既可观察到样品的内部 结构,又可观察到富有立体感的图像,还提高了分辨率
2. 扫描电镜的成像原理 电子枪发射出的电子束，经电磁透镜会聚成极细的电子束，并进而聚焦在待测样品表面； 由于样品各不同部位的表面形貌不同，入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用 后所产生的次级电子信号也不同; 此次级电子信号为探测器接受后, 被转变成光子，传递给 光电倍增管进行放大和转换；转换成的电压信号经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏 上。 由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描，再加上显象管的偏转线圈电流与扫描 线圈电流高度同步，因此，显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的 次级电子数均是一一对应的，因此，显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。 综上所述，扫描电镜在结构和工作原理上均不同于透射电镜。如(1)扫描电镜所用样品 的制备方法简便, 不需经过超薄切片，经固定、干燥和喷金后即可；(2)扫描电镜采用的是次 级电子成像; (3)扫描电镜所观察到图像景深长, 图像富有立体感, 但只能反映出样品的表面 形貌; (4)图像的放大倍率在很大范围内是连续可变的(101~105×);(5)样品的辐射损伤及污染 程度小等。但与透射电镜相比，扫描电镜又存在有其不可逾越的局限性，如(1)分辨率还不 够高; (2)无法显示样品内部的详细结构等。为此，近年来出现了一种新的电镜技术-冰冻蚀刻 技术(freeze etching)，利用“复膜(replica)”在透射电镜下进行观察, 既可观察到样品的内部 结构, 又可观察到富有立体感的图像, 还提高了分辨率
实验二孚尔根反应( Feulgen reaction) Feulgen反应( Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应,为学者 Feulgen 和 Rossenbeck于1924年发明,简称为 Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性 故常被用来显示细胞内DNA的分布情况 实验目的 1.熟悉并掌握 Feulgen反应的原理及其实验操作方法 2.对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识 实验原理 自 Feulgen等发明该显示DNA的 Feulgen反应法以来,其作用机制也久经研究和讨论 现已取得一致意见。其具体反应原理是,标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被 解离,从而在核糖的一端出现了醛基。 Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌 基的化合物分子,因醌基为发色团,故可呈现出紫红色。也就是说,DNA经稀酸水解后产生 的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示出DNA的分布 其反应机制如下图所示。 2HCI+Na2S,0s-2NaCl+SO+H2SO C O-sc H t 2HS0- H2N PNH2 性品红 OH ≥ NHSOZC-H +s2→h2 K>NHSO=H →H2N iNH2 SO3H PNHC-H 6 NHSO2C-H RPH+02+H2(<:吠喃) 2NH2SO2-C-H 紫红 实验用品 、器材显微镜20台、立式染色缸80个、水浴锅1台。 材料香柏油5瓶,擦镜纸5本,镊子5把,盖玻片20片,用 carnoy's固定液 固定的肝脏和精巢切片20片
实验二 孚尔根反应（Feulgen Reaction） Feulgen 反应(Feulgen reaction)是显示 DNA 的最典型的组织化学反应，为学者 Feulgen 和 Rossenbeck 于 1924 年发明，简称为 Feulgen 法。因对 DNA 的显示反应具有高度专一性， 故常被用来显示细胞内 DNA 的分布情况。 实 验 目 的 1. 熟悉并掌握 Feulgen 反应的原理及其实验操作方法 2. 对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识 实 验 原 理 自 Feulgen 等发明该显示 DNA 的 Feulgen 反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论， 现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA 分子中的嘌呤碱基被 解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff 试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌 基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA 经稀酸水解后产生 的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出 DNA 的分布。 其反应机制如下图所示。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3 实 验 用 品 一、器材 显微镜 20 台、立式染色缸 80 个、水浴锅 1 台。 二、材料 香柏油 5 瓶，擦镜纸 5 本，镊子 5 把，盖玻片 20 片，用 carnoy's 固定液 固定的肝脏和精巢切片 20 片
三、试剂 schi氏试剂将θ5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中,时时摇动玻璃瓶, 煮沸5min使之充分溶解,冷却至50℃时过滤,加入10 ml lmol/L HCl,冷至25℃时,加入 0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠( NasO3),在室温泠暗处至少放置24h(有时需 2~3天),使其颜色退至淡黄色,密封瓶口,藏于暗处,最好保存于4℃冰箱中(可保存数月 或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳,摇lmin,用粗滤纸过滤,滤液应为无色;若液体 颜色变为粉红色,便不能再用 2.亚硫酸水(洗涤剂用200m普通自来水(不要用蒸馏水,以免引起误差)、1Oml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10 ml lmol/LHCl,三者在使用前混合,现用现配 3.lmol/LHCl(水解用)取825ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水10m即成(应将盐 酸缓缓加入水中)。 4.1%亮绿( light green)亮绿1g,溶于100ml蒸馏水中 5.30%、50%、70%、85%、95%100%的梯度酒精及二甲苯 实验方法 液固定 95%酒精(2次)每次20-30min 100%酒精2次(30min,40min) 二甲苯透明 石腊包埋 切片贴片 二甲苯I(20min) 二甲苯I(10min) 100%酒精5min 95%酒精5min
三、试剂 1. schiff 氏试剂 将 0.5g 碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶， 煮沸 5min 使之充分溶解，冷却至 50℃时过滤，加入 10ml 1mol/L HCl，冷至 25℃时，加入 0.5g 偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置 24h(有时需 2~3 天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于 4℃冰箱中(可保存数月 或更长时间)。在使用前加入 0.5g 活性碳, 摇 1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体 颜色变为粉红色，便不能再用。 2. 亚硫酸水(洗涤剂) 用 200ml 普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和 10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。 3. 1mol/L HCl(水解用) 取 82.5ml 比重为 1.19 的盐酸加蒸馏水 1000ml 即成(应将盐 酸缓缓加入水中)。 4. 1%亮绿(light green) 亮绿 1g，溶于 100ml 蒸馏水中。 5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。 实 验 方 法 Carnoy 液固定 ↓ 95%酒精（2 次）每次 20-30min ↓ 100%酒精 2 次(30 min, 40 min) ↓ 二甲苯透明 ↓ 石腊包埋 ↓ 切片贴片 ↓ 二甲苯 I(20 min) ↓ 二甲苯 II(10 min) ↓ 100%酒精 5min ↓ 95%酒精 5min