52 食品安全与卫生检测 实训教学指导书 （食品加工技术专业、食品安全监测专业） 吉林粮食高等专科学校 2004 年 6 月
52 食品安全与卫生检测 实训教学指导书 （食品加工技术专业、食品安全监测专业） 吉林粮食高等专科学校 2004 年 6 月
53 《食品安全与卫生检测》实训指导书 依据《食品安全与卫生检测》课程教学大纲的要求，结合我校的实际情况， 编写本指导书，作这《食品安全与卫生检测》任课教师教学参考和食品工程专 业教学用书。全书共分 10 个实训专题，建议教学学时为 30～50 学时。 《食品安全与卫生检测》是在学过分析化学、食品生物化学、食品微生物 学等课程的基础上开设的，与《食品营养与检测》构成了一个既相互联系、又 相对独立的有机整体，是高职高专院校食品加工技术专业一门技术性、实践性 很强的专业基础课程，是能够把基础课与专业课紧密联结起来的一门应用科学。 该课程主要讲授食品的安全卫生、食品卫生检测有关知识、食品卫生检测技术、 食品安全管理、食品卫生监督、国家食品卫生法与世界卫生组织、典型食品安 全卫生案例分析等。 通过本课程各教学环节，要求学生掌握从事食品生产与加工、食品营销及 检测等职业岗位群工作所必须具备的基本知识、基本原理和基本技能；能合理 运用所学知识和技能，提高食品品质，保证食品的安全性。使学生在食品加工 实践中具备发现问题、分析问题和解决问题的能力；了解国内外食品安全与检 测的科学技术动向。 因此，本课程承担着培养食品专业高级实用型专门人才和提高食品安全、 卫生检测技术的双重任务。 在具体实施中，既可以采取理论与实训结合的教学形式，也可单独组织实 训教学。要强调所有实际操作必须符合食品行业卫生规范、职场卫生健康、操 作规程等的要求。要强调紧密结合生产实践，改革实验教学内容，减少演示性、 验证性实验，增加工艺性、设计性、综合性实验，逐步形成基本实践能力与操 作技能、综合实践能力与综合技能有机结合的实践教学体系。构建具有高职高 专食品专业特色的“实验、认识实习、生产实习、专业综合训练、毕业实习” 的实践教学模式。 吉林粮食高等专科学校 食品科学与工程系 2004 年 6 月
53 《食品安全与卫生检测》实训指导书 依据《食品安全与卫生检测》课程教学大纲的要求，结合我校的实际情况， 编写本指导书，作这《食品安全与卫生检测》任课教师教学参考和食品工程专 业教学用书。全书共分 10 个实训专题，建议教学学时为 30～50 学时。 《食品安全与卫生检测》是在学过分析化学、食品生物化学、食品微生物 学等课程的基础上开设的，与《食品营养与检测》构成了一个既相互联系、又 相对独立的有机整体，是高职高专院校食品加工技术专业一门技术性、实践性 很强的专业基础课程，是能够把基础课与专业课紧密联结起来的一门应用科学。 该课程主要讲授食品的安全卫生、食品卫生检测有关知识、食品卫生检测技术、 食品安全管理、食品卫生监督、国家食品卫生法与世界卫生组织、典型食品安 全卫生案例分析等。 通过本课程各教学环节，要求学生掌握从事食品生产与加工、食品营销及 检测等职业岗位群工作所必须具备的基本知识、基本原理和基本技能；能合理 运用所学知识和技能，提高食品品质，保证食品的安全性。使学生在食品加工 实践中具备发现问题、分析问题和解决问题的能力；了解国内外食品安全与检 测的科学技术动向。 因此，本课程承担着培养食品专业高级实用型专门人才和提高食品安全、 卫生检测技术的双重任务。 在具体实施中，既可以采取理论与实训结合的教学形式，也可单独组织实 训教学。要强调所有实际操作必须符合食品行业卫生规范、职场卫生健康、操 作规程等的要求。要强调紧密结合生产实践，改革实验教学内容，减少演示性、 验证性实验，增加工艺性、设计性、综合性实验，逐步形成基本实践能力与操 作技能、综合实践能力与综合技能有机结合的实践教学体系。构建具有高职高 专食品专业特色的“实验、认识实习、生产实习、专业综合训练、毕业实习” 的实践教学模式。 吉林粮食高等专科学校 食品科学与工程系 2004 年 6 月
54 实训一 花生中黄曲霉毒素 B1的检测 一、目的 1、熟练掌握薄层层析法原理。 2、掌握薄层层析操作作方法。 二、原理 样品中黄曲霉毒素 B1经有机溶剂提取，浓缩、净化以及薄层分离前处理后， 在波长 365nm 紫外光下产生兰紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检 出量来测定含量。 三、试剂 1．三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、丙酮 2．正己烷（沸程 30～60℃）或石油醚（沸程 60～90℃）. 3．无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水 4．苯――乙腈（98：2）混合溶液：量取 98ml 苯，加 2ml 乙腈，混匀。 5．甲醇――水（55：45）溶液：配制方法同上。 6．三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠 7．硅胶 G，薄层色谱用。 8．AFTB1 标准溶液的制备：用百万分之一的微量分析天平精密称取 1～ 1.2mgAFTB1标准品，先加入 2ml 乙腈溶解后，再用苯稀释至 100ml。然后避光 置于 4℃冰箱中保存。最后进行 AFTB1标准溶液浓度的测定。（此标准溶液浓度 为 10μg/ml）。 9．AFTB1标准使用液Ⅰ：精密吸取 1ml10μg/ml 标准溶液于 10ml 容量瓶中， 加苯－乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液浓度为 1μg/ml。 10．AFTB1标准使用液Ⅱ：精密吸取 1.0ml1μg/mlAFTB1标准使用液Ⅰ于 5ml 容量瓶中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.2μg/ml。 11．AFTB1标准使用液Ⅲ：精密吸取 1.0mlAFTB1标准使用液Ⅱ于 5ml 容量瓶 中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.04μg/ml。 12．50/L 次氯酸钠溶液：取 100g 漂白精，加入 500ml 水，搅拌均匀。另将 160g 工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于 500ml 温水中，再将两液混合，搅拌， 澄清后，再过滤即可。 四、仪器和用具 1．小型粉碎机、样筛、电动振荡器 2．全玻璃浓缩器、电子恒温水浴锅、薄层板涂布器 3．玻璃板：5cm×20cm。 4．展开槽：内长 25cm，宽 6cm，高 4cm。 5．紫外光灯：100～125W，带有波长 365nm 滤光片 6．微量进样器、蒸发器：50ml 五、操作步骤 1．样品提取、净化
54 实训一 花生中黄曲霉毒素 B1的检测 一、目的 1、熟练掌握薄层层析法原理。 2、掌握薄层层析操作作方法。 二、原理 样品中黄曲霉毒素 B1经有机溶剂提取，浓缩、净化以及薄层分离前处理后， 在波长 365nm 紫外光下产生兰紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检 出量来测定含量。 三、试剂 1．三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、丙酮 2．正己烷（沸程 30～60℃）或石油醚（沸程 60～90℃）. 3．无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水 4．苯――乙腈（98：2）混合溶液：量取 98ml 苯，加 2ml 乙腈，混匀。 5．甲醇――水（55：45）溶液：配制方法同上。 6．三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠 7．硅胶 G，薄层色谱用。 8．AFTB1 标准溶液的制备：用百万分之一的微量分析天平精密称取 1～ 1.2mgAFTB1标准品，先加入 2ml 乙腈溶解后，再用苯稀释至 100ml。然后避光 置于 4℃冰箱中保存。最后进行 AFTB1标准溶液浓度的测定。（此标准溶液浓度 为 10μg/ml）。 9．AFTB1标准使用液Ⅰ：精密吸取 1ml10μg/ml 标准溶液于 10ml 容量瓶中， 加苯－乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液浓度为 1μg/ml。 10．AFTB1标准使用液Ⅱ：精密吸取 1.0ml1μg/mlAFTB1标准使用液Ⅰ于 5ml 容量瓶中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.2μg/ml。 11．AFTB1标准使用液Ⅲ：精密吸取 1.0mlAFTB1标准使用液Ⅱ于 5ml 容量瓶 中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.04μg/ml。 12．50/L 次氯酸钠溶液：取 100g 漂白精，加入 500ml 水，搅拌均匀。另将 160g 工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于 500ml 温水中，再将两液混合，搅拌， 澄清后，再过滤即可。 四、仪器和用具 1．小型粉碎机、样筛、电动振荡器 2．全玻璃浓缩器、电子恒温水浴锅、薄层板涂布器 3．玻璃板：5cm×20cm。 4．展开槽：内长 25cm，宽 6cm，高 4cm。 5．紫外光灯：100～125W，带有波长 365nm 滤光片 6．微量进样器、蒸发器：50ml 五、操作步骤 1．样品提取、净化
55 样品去壳去皮粉碎后，称取 20g 粉碎过筛样品，置于 250ml 具塞锥形瓶中， 加 30ml 正乙烷或石油醚和 100ml 甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。 振荡 30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，等 下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶中。取 20.0ml 甲醇 水溶液提取液（相当于 4g 样品）置于另一个 125ml 分液漏斗中，加 20mlCHCl3， 振摇 2min，静置分层（如出现乳化则可滴加甲醇使其分层），放出 CHCl3层，经 盛有约10g先用CHCl3湿润的无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于50ml蒸发皿中， 分液漏斗中再加 5mlCHCl3重复振摇提取，CHCl3层一并滤于蒸发皿中，最后用少 量 CHCl3洗滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风橱内于 65℃水浴上通 风挥干，然后放在冰箱内冰却 2－3min 后，准确加入 1ml 苯－乙腈混合液（或 将 CHCl3用浓缩蒸馏器减压吹干蒸干，然后再准确加入 1ml 苯－乙腈混合液）。 用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，如果有苯的结晶析出，则将蒸发皿 取下，继续溶解、混合，晶体则立即消失，再用此滴管吸取上清液转移于 2ml 具塞试管中。 2．样品的测定（单向展开法） （1）薄层板的制备：称取约 3g 硅胶 G，加入相当于硅胶量 2－3 倍左右的 水，用力研磨 1－2min 至成糊状后立即倒入涂布器内，推成 5×20cm，厚度约 0.25mm 的簿层板三块。在空气中干燥大约 15min 后，放入 100℃烘箱内活化 2h， 取出在干燥器中保存。一般可保存 2－3d，若放置时间较长，可再进行干燥活 化后使用。 （2）点样：将簿层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 处做一 个基线，然后在基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边 缘和点间距约为 1cm，点直径约为 3mm。要求在同一块板上滴加点的大小应一致， 可用吹风机冷风边吹边加。滴加的样点如下： 第一点：10μl、0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样品溶液。 第三点：20μl 样液＋10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液＋10μl 0.2μg/mlAFTB1标准使用液。 （3）展开与观察：加入 10ml 无水乙醚于展开槽内，预展 12cm，取出挥干。 再于另一展开槽内加入 10ml 丙酮：三氯甲烷（8：92）溶剂，展开 10－12cm， 取出在紫外光下观察结果，方法如下： ①第一点滴加 10μlAFTB1标准使用液，其中含 AFTB10.04μg/ml（最低检出 量 5μg/kg）。可作为检验薄层板好坏及色谱是否合适，能检出最低检出量。如果 展开后此点无荧光，则说明薄层板或色谱条件存在问题。 ②第三点和第四点上滴加了样液和 AFTB1标准液，可使样液中的 AFTB1荧光 点和标液 AFTB1荧光点重叠。加以认证。 第三点是用来检验最低检出量在样液中是否能正常呈现，如果第一点呈阳 性，第三点呈阴性则说明样品的提取存在问题，可能存在荧光猝灭剂，应重新
55 样品去壳去皮粉碎后，称取 20g 粉碎过筛样品，置于 250ml 具塞锥形瓶中， 加 30ml 正乙烷或石油醚和 100ml 甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。 振荡 30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，等 下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶中。取 20.0ml 甲醇 水溶液提取液（相当于 4g 样品）置于另一个 125ml 分液漏斗中，加 20mlCHCl3， 振摇 2min，静置分层（如出现乳化则可滴加甲醇使其分层），放出 CHCl3层，经 盛有约10g先用CHCl3湿润的无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于50ml蒸发皿中， 分液漏斗中再加 5mlCHCl3重复振摇提取，CHCl3层一并滤于蒸发皿中，最后用少 量 CHCl3洗滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风橱内于 65℃水浴上通 风挥干，然后放在冰箱内冰却 2－3min 后，准确加入 1ml 苯－乙腈混合液（或 将 CHCl3用浓缩蒸馏器减压吹干蒸干，然后再准确加入 1ml 苯－乙腈混合液）。 用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，如果有苯的结晶析出，则将蒸发皿 取下，继续溶解、混合，晶体则立即消失，再用此滴管吸取上清液转移于 2ml 具塞试管中。 2．样品的测定（单向展开法） （1）薄层板的制备：称取约 3g 硅胶 G，加入相当于硅胶量 2－3 倍左右的 水，用力研磨 1－2min 至成糊状后立即倒入涂布器内，推成 5×20cm，厚度约 0.25mm 的簿层板三块。在空气中干燥大约 15min 后，放入 100℃烘箱内活化 2h， 取出在干燥器中保存。一般可保存 2－3d，若放置时间较长，可再进行干燥活 化后使用。 （2）点样：将簿层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 处做一 个基线，然后在基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边 缘和点间距约为 1cm，点直径约为 3mm。要求在同一块板上滴加点的大小应一致， 可用吹风机冷风边吹边加。滴加的样点如下： 第一点：10μl、0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样品溶液。 第三点：20μl 样液＋10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液＋10μl 0.2μg/mlAFTB1标准使用液。 （3）展开与观察：加入 10ml 无水乙醚于展开槽内，预展 12cm，取出挥干。 再于另一展开槽内加入 10ml 丙酮：三氯甲烷（8：92）溶剂，展开 10－12cm， 取出在紫外光下观察结果，方法如下： ①第一点滴加 10μlAFTB1标准使用液，其中含 AFTB10.04μg/ml（最低检出 量 5μg/kg）。可作为检验薄层板好坏及色谱是否合适，能检出最低检出量。如果 展开后此点无荧光，则说明薄层板或色谱条件存在问题。 ②第三点和第四点上滴加了样液和 AFTB1标准液，可使样液中的 AFTB1荧光 点和标液 AFTB1荧光点重叠。加以认证。 第三点是用来检验最低检出量在样液中是否能正常呈现，如果第一点呈阳 性，第三点呈阴性则说明样品的提取存在问题，可能存在荧光猝灭剂，应重新
56 提取。 第四点主要是起定位作用。AFTB1的 Rf 值约 0.6。 ③第二点起判断作用。如果第二点（样液）在 AFTB1标准点的相应位置（Rf ≈0.6）处呈阴性，而其它各点均呈阳性，则说明样品中 AFBT1的含量在 5μg/kg （最低检出量）以下，如果第二点在其相应位置上呈阳性，则需进行确证试验。 （4）确证试验：为了证明在薄层板上样液呈现的荧光确系由 AFTB1产生的， 则在样点上滴加三氟乙酸，产生 AFTB1的衍生物，继续展开后，此衍生物的 Rf 值约为 0.1 左右。方法如下： 依次在薄层板左边滴加两个点： 第一点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样液。 在以上两点处各加一小滴三氟乙酸盖于其上，经反应 5min 后，用电吹风机 吹热风 2min，热风吹到薄层板上的温度不得高于 40℃，再于薄板右边滴加以下 两点。 第三点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液。 同前展开后，在紫外光下观察样液是否产生与 AFTB1标准点相同的衍生物。 第三点和第四点，可作为样液与标准衍生物的空白对照。 （5）稀释定量：样液中的 AFTB1荧光点的荧光强度与 AFTB1标准点（最低检 出量）的荧光强度一致，则表示样品 AFTB1 含量在 5μg/kg；如样液中荧光强 度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量或将样液稀释后再点样，直 至样液点的荧光强调与最低检出量的荧光强度一致为止，滴加样式如下： 第一点：10μg/ml AFTB1标使液。 第二点：根据具体情况点 10μl 样液。 第三点：根据具体情况点 15μl 样液。 第四点：根据具体情况点 20μl 样液。 （6）计算： X=0.0004× V m V D 2 1 （3－1） 式中：X —— 样品中 AFTB1的含量，μg/kg； V1 —— 稀释前样液的体积，ml； V2 —— 出现同样最低荧光强度时滴加样液的点样量，μl； D —— 样液的总稀释倍数； m —— 稀释前相当样品的质量，g； 0.0004 —— AFTB1的最低检出量，μg。 注意事项 1．本法的灵敏度较高，容易产生误差。如薄层板制作不平整、不均匀，点
56 提取。 第四点主要是起定位作用。AFTB1的 Rf 值约 0.6。 ③第二点起判断作用。如果第二点（样液）在 AFTB1标准点的相应位置（Rf ≈0.6）处呈阴性，而其它各点均呈阳性，则说明样品中 AFBT1的含量在 5μg/kg （最低检出量）以下，如果第二点在其相应位置上呈阳性，则需进行确证试验。 （4）确证试验：为了证明在薄层板上样液呈现的荧光确系由 AFTB1产生的， 则在样点上滴加三氟乙酸，产生 AFTB1的衍生物，继续展开后，此衍生物的 Rf 值约为 0.1 左右。方法如下： 依次在薄层板左边滴加两个点： 第一点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样液。 在以上两点处各加一小滴三氟乙酸盖于其上，经反应 5min 后，用电吹风机 吹热风 2min，热风吹到薄层板上的温度不得高于 40℃，再于薄板右边滴加以下 两点。 第三点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液。 同前展开后，在紫外光下观察样液是否产生与 AFTB1标准点相同的衍生物。 第三点和第四点，可作为样液与标准衍生物的空白对照。 （5）稀释定量：样液中的 AFTB1荧光点的荧光强度与 AFTB1标准点（最低检 出量）的荧光强度一致，则表示样品 AFTB1 含量在 5μg/kg；如样液中荧光强 度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量或将样液稀释后再点样，直 至样液点的荧光强调与最低检出量的荧光强度一致为止，滴加样式如下： 第一点：10μg/ml AFTB1标使液。 第二点：根据具体情况点 10μl 样液。 第三点：根据具体情况点 15μl 样液。 第四点：根据具体情况点 20μl 样液。 （6）计算： X=0.0004× V m V D 2 1 （3－1） 式中：X —— 样品中 AFTB1的含量，μg/kg； V1 —— 稀释前样液的体积，ml； V2 —— 出现同样最低荧光强度时滴加样液的点样量，μl； D —— 样液的总稀释倍数； m —— 稀释前相当样品的质量，g； 0.0004 —— AFTB1的最低检出量，μg。 注意事项 1．本法的灵敏度较高，容易产生误差。如薄层板制作不平整、不均匀，点