第十章蛋白质和氨基酸的测定 第一节概述 蛋白质品生命的物质基础，是构成牛物体细胞组织的重要成分，总牛物体发有及修补细 织的原料 切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸、碱及水分平衡， 信息的传递，物质代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解 产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。 蛋白质在食品中含量的变化范围很宽。动物来源和豆类食品是优良的蛋白质资源。部分 种类食品的蛋白质含量见表10-1 表10-1部分食品的蛋白质含量 蛋白质的质量 蛋白质的质 食品种类 分数（以湿基 食品种类 量分数（以湿 计)% 基计)% 谷类和面食 土豆（整粒、肉和皮） 2.1 大米（糙米、长粒、生） 7.9 大米（白米、长粒、生、 大豆（成熟的种子、生） 36.5 强化) 71 豆（腰子状、所有品种 23.6 小老船（整粒】 13.7 成熟的种子、生) 玉米粉（整粒、黄色 69 豆腐（生、坚硬〉 15.6 意大利面条（干、强化） 12.8 豆腐（生、普通） 8.1 玉米淀粉 0.3 肉、家禽、鱼 乳制品 牛肉（颈肉、烤前腿） 18.5 牛乳（全脂、液体） 33 牛肉（膝制、干生牛肉） 29.1 牛乳（脱脂、干） 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、 23.1 切达干酪 24 酸奶（普通的、低脂） 5.3 火腿（切片、普通的】 17.6 水果和蔬菜 鸡蛋（生、全蛋） 12.5 苹果（生、带皮） 0.2 角（太平洋钙鱼、生） 17.9 芦算（牛） 23 角（金拾角、白伍、带 26.5 草莓（生） 0.6 装、油浸、滴干的固体】 莴苣（冰、生） 1.0 蛋白质是复杂的含氮有机化合物， 摩尔质量大， 大部分高达数万~数百万，分子的长轴 则长达lnm~100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺健以一定的方式结合起来，并具有一定 的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、 F、I等元素，但含氨则是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氢量也不同」 般蛋白质含氨量为16%，即1份氨相当于6.25份蛋白质，此数值(6.25)称为蛋白质系
第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组 织的原料。一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸、碱及水分平衡，遗传 信息的传递，物质代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解 产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。 蛋白质在食品中含量的变化范围很宽。动物来源和豆类食品是优良的蛋白质资源。部分 种类食品的蛋白质含量见表 10-1 表 10-1 部分食品的蛋白质含量 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，摩尔质量大，大部分高达数万～数百万，分子的长轴 则长达 1nm～100nm，它们由 20 种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定 的空间结构，所含的主要化学元素为 C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、 Fe、I 等元素，但含氮则是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。 一般蛋白质含氮量为 16%，即 1 份氮相当于 6.25 份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系 食 品 种 类 蛋白质的质量 分数（以湿基 计）/% 食 品 种 类 蛋白质的质 量分数（以湿 基计）/% 谷类和面食 大米（糙米、长粒、生） 7.9 大米（白米、长粒、生、 强化） 7.1 小麦粉（整粒） 13.7 玉米粉（整粒、黄色） 6.9 意大利面条（干、强化） 12.8 玉米淀粉 0.3 乳制品 牛乳（全脂、液体） 3.3 牛乳（脱脂、干） 36.2 切达干酪 24.9 酸奶（普通的、低脂） 5.3 水果和蔬菜 苹果（生、带皮） 0.2 芦笋（生） 2.3 草莓（生） 0.6 莴苣（冰、生） 1.0 土豆（整粒、肉和皮） 2.1 豆类 大豆（成熟的种子、生） 36.5 豆（腰子状、所有品种、 23.6 成熟的种子、生） 豆腐（生、坚硬） 15.6 豆腐（生、普通） 8.1 肉、家禽、鱼 牛肉（颈肉、烤前腿） 18.5 牛肉（腌制、干牛肉） 29.1 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、 23.1 生） 火腿（切片、普通的） 17.6 鸡蛋（生、全蛋） 12.5 鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.9 鱼（金枪鱼、白色、罐 26.5 装、油浸、滴干的固体）
数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为625，花生为 546,大米为595，大目及其制品为571，小麦粉为570、生穷及其制品为638。 、酸或碱水解，其水解的中间产物为际、 、肚。终产物为日 质的最基 物质 虽名 各种天然物 分离得到的氨基酸已达 种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨 酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体 中不能合成，必须依靠食物供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有若极其重要的生理功 能，常会因其在体内缺乏而导致忠病或通过补充而增强了新陈代谢作用。随者食品科学的发 展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成， 愈来愈得到人 们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品的开发及合理配膳等工作都具有极其重要的 意义。 测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氨量、肽键和折射 率等测定蛋白质含最：另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和威性因以及芳香基 团等测定蛋白质含量。但因食品种类繁多，食品中蛋白质含量各异，特别是其它成分，如碳 水化合物、脂和维生素等干扰成分很多，因此蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氨法 它是测定总有机氨的最准确和操作较简使的方法之一，在国内外应用普遍。该法是通过测出 样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非 蛋白质含氨化合物，放此法的结果称为相蛋白质含量。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试式 剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 近年来。 凯氏 不断 研究政进 使其在应用范围 分析结果的准确度 器 装置及分析操作速度等方面均取得了新的进步。另外，国外采用红外分析仪，利用波长在 0.75~3μm范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收及反射的特性，依据红外线的 反射强度与食品中蛋白质含量之间存在的函数关系而建立了近红外光谱快速定量方法。 整干食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常检验中多定样品中的氨基酸总量 通常采用酸碱滴定法来完成。色谱技术的发展为各种氨基酸的分 离 鉴定及定最提供了有力 的工具，近年来世界上已出现了多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成 为现实。另外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基酸的软件，通过电脑控制进行自动检测 和计算，也可以快速、准确地测出各类氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测 定方法。 第二节蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 1.氨其里法 H CoH-N _N=NCeH-NO HO3S 、S0h 氨基黑10B是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料
数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为 6.25，花生为 5.46，大米为 5.95，大豆及其制品为 5.71，小麦粉为 5.70、牛乳及其制品为 6.38。 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的中间产物为月示、胨、肽等，最终产物为氨基 酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然物中分离得到的氨基酸已达 175 种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的 20 种，而在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨 酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等 8 种氨基酸在人体 中不能合成，必须依靠食物供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功 能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。随着食品科学的发 展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人 们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品的开发及合理配膳等工作都具有极其重要的 意义。 测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射 率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基 团等测定蛋白质含量。但因食品种类繁多，食品中蛋白质含量各异，特别是其它成分，如碳 水化合物、脂肪和维生素等干扰成分很多，因此蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法， 它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。该法是通过测出 样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非 蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试 剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 近年来，凯氏定氮法经不断的研究改进，使其在应用范围、分析结果的准确度、仪器 装置及分析操作速度等方面均取得了新的进步。另外，国外采用红外分析仪，利用波长在 0.75～3μm 范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收及反射的特性，依据红外线的 反射强度与食品中蛋白质含量之间存在的函数关系而建立了近红外光谱快速定量方法。 鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量， 通常采用酸碱滴定法来完成。色谱技术的发展为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力 的工具，近年来世界上已出现了多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成 为现实。另外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基酸的软件，通过电脑控制进行自动检测 和计算，也可以快速、准确地测出各类氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测 定方法。 第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 1．氨基黑法 C6H5N HO3S H NH2 N=NC6H4NO SO3H 氨基黑 10B 是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料
(1)经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑10B酷酸甲醇溶液(13g氨基黑 10B溶解于100mL冰醋酸和900mL甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次) 染色后 用10%醋酸甲醇溶液洗涤约5一7次 待背景变成浅蓝色后干燥 若欲进行洗脱，用0.1mol/L氢氧化钠浸泡30min,于595nm比色测定。 (2)聚丙稀酰胺凝胶电泳后染色：用甲醇固定后，在含1%氨基黑10B0.1mol/L氢氧化 钠溶液中染色5mi(室温)，用5%乙醇洗脱背景底色。或用7%醋酸固定后，于96℃水浴中 用7%醋酸（含0.5%1%氨基里10B)染色10min.7%醋酸洗脱背景底色。用氨其里10B染 SDS-蛋白质时效果不好。如果凝胶中含有兼性离子载体，先用10%三氯酷酸浸泡，每隔2h 换液一次，约10次，再进行染色。 (3)凝胶薄层的直接染色：将凝胶薄层放在一定湿度的烘箱内逐步干燥(50℃)，没有 调温调湿箱时用一张滤纸放于烘箱内，以保持一定的湿度。将干燥的薄层板于漂洗液(750 mL甲醇，200mL水，50mL冰醋酸)中预处理10min,然后在染色液(750mL甲醇，200m 水，50ml冰醋酸，在此溶液中加氨基黑10B饱和)中染色5h,再在漂洗液内洗涤。 本法优点是灵敏度较高 缺点是花费时间长 不同蛋白质染色强度不同。 2.溴酚蓝法 经电泳或层析后滤纸或凝胶于0.1%溴酚蓝固定染色液(1g溴酚蓝，100g氯化汞溶于 50%乙醇水溶液中，用50%乙醇稀释至1000mL)中浸泡15~20min,在30%乙醇：5%醋酸 水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱， 可用0.1 mol/LNaOH, SO.H 此法缺点是灵敏度低，某些摩尔质量低的蛋白质可能染不上颜色。 3.考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝R250 该垫料和蛋白质是通过带德华力结合的。老马断高蓝令有梦多值水基团，和蛋白质的请 水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色时漂洗要 容易得多。 (1)经电泳后滤纸或醋酸纤维膜在200gL磺基水杨酸溶液中浸1mn,取出后放入 2.5gL考马斯亮蓝R250染色液（配制用的蒸馏水内不含有重金属离子）浸5min,在蒸馏水
（1）经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑 10B 醋酸甲醇溶液（13g 氨基黑 10B 溶解于 100mL 冰醋酸和 900mL 甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次） 中，染色 10min，染色后，用 10%醋酸甲醇溶液洗涤约 5～7 次，待背景变成浅蓝色后干燥。 若欲进行洗脱，用 0.1mol/L 氢氧化钠浸泡 30min，于 595nm 比色测定。 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色：用甲醇固定后，在含 1%氨基黑 10B 0.1mol/L 氢氧化 钠溶液中染色 5min(室温)，用 5%乙醇洗脱背景底色。或用 7%醋酸固定后，于 96℃水浴中 用 7%醋酸（含 0.5％～1%氨基黑 10B）染色 10min,7%醋酸洗脱背景底色。用氨基黑 10B 染 SDS-蛋白质时效果不好。如果凝胶中含有兼性离子载体，先用 10%三氯醋酸浸泡，每隔 2h 换液一次，约 10 次，再进行染色。 （3）凝胶薄层的直接染色：将凝胶薄层放在一定湿度的烘箱内逐步干燥（50℃），没有 调温调湿箱时用一张滤纸放于烘箱内，以保持一定的湿度。将干燥的薄层板于漂洗液（750 mL 甲醇，200mL 水，50mL 冰醋酸）中预处理 10min，然后在染色液（750mL 甲醇，200mL 水，50mL 冰醋酸，在此溶液中加氨基黑 10B 饱和）中染色 5h,再在漂洗液内洗涤。 本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间长，不同蛋白质染色强度不同。 2．溴酚蓝法 经电泳或层析后滤纸或凝胶于 0.1%溴酚蓝固定染色液（1g 溴酚蓝，100g 氯化汞溶于 50%乙醇水溶液中，用 50%乙醇稀释至 1000mL）中浸泡 15～20min，在 30%乙醇：5%醋酸 水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱，可用 0.1mol/LNaOH。 Br HO Br C C6H4SO3H O Br Br 此法缺点是灵敏度低，某些摩尔质量低的蛋白质可能染不上颜色。 3．考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝 R250 CH2 N C N CH2 C2H5 C2H5 NH OC2H5 SO3Na SO3 - 该染料和蛋白质是通过范德华力结合的。考马斯亮蓝含有较多疏水基团，和蛋白质的疏 水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色时漂洗要 容易得多。 （1）经电泳后滤纸或醋酸纤维膜在 200g/L 磺基水杨酸溶液中浸 1min，取出后放入 2.5g/L 考马斯亮蓝 R250 染色液（配制用的蒸馏水内不含有重金属离子）浸 5min，在蒸馏水
或7%醋酸中洗四次，每次5min,于90℃放置15min。 (2)聚丙烯酰胺凝胶也可同上处理。在酸性醇溶液中，考马斯亮蓝兼性离子载体络合 物溶解度显著增大，因此能免去清除兼性离子载体的步骤。可运用下列方法之 凝胶用10 氯醋酸固定，在10%三氯醋酸-1%考马斯亮蓝R250(19+1)中室温染色 0.5h,用10%三氯醋酸脱底色。 凝胶浸入预热至60℃的0.1%考马斯亮蓝固定染色液(150g三氯醋酸，45g磺基水杨酸 溶于375mL甲醇和930mL蒸馏水的混合液。每1g考马斯亮蓝R250溶于此混合液1000mL 中)中约30m,用酸性乙应画洗液（乙位+水+冰酷酸=25+25+8）洗尽背是颜色。垫色后 凝胶保存于酸性乙醇漂洗液中。本法灵敏度：卵清蛋白0.03g,血清清蛋白0.02μg,血 蛋白0.01μg。 凝胶浸入考马斯亮蓝固定染色液(2g考马斯亮蓝R250,溶于100mL蒸馏水中，加2mo/1 硫酸1OOmL,过滤除去沉淀，向清液中滴加10 mol/LKOH至颜色从绿变蓝为止。量体积， 每100mL加入三怎酷酸12g)中1h,然后用蒸榴水洗净背量颜色或在02%H,S0.溶液中污 泡片刻脱除背景颜色。染色后的凝胶保存于蒸馏水中。本法机制未明 ,起染色作用的可能不 是考马斯亮蓝本身 灵敏度不如上法 考马撕斯亮蓝法灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于SDS电泳的微最蛋白质的染色。在 549nm有最大吸收值，蛋白质在1~10μg呈线性关系。 4.酸性品红法 经电泳后滤纸置于0.2%酸性品红溶液中(2g酸性品红溶解于500mL甲醇，400mL蒸 馏水和100mL冰醋酸中)加热染色15min:取出后浸入醋酸甲醇溶液(500mL甲醇，加400ml 蒸馏水和100mL冰醋酸)15min:然后浸入10%醋酸溶液，每次20min,至背景无色为止。 若欲进行比色，可用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡2，在波长为570nm处比色。 5.氨基萘酚磺酸法 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露于空气中几分钟，或在2mo/LHC1中浸一下使表 层蛋白变性，再在0.003%氨基萘酚磺酸的0.1molL磷酸盐缓冲液(pH6.8)中染3min,在 紫外光下可显黄绿色荧光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性 时，可先在3mol1HC1中浸2min以上使蛋白质充分变性，再染色。 二、复合蛋白质的显色反应 1.糖蛋白的显色 (1)过碘酸.Schiff氏试剂显色法 试剂 过碘酸液：1.2g过碘酸溶解于30mL蒸馏水中，加15mL0.2molL醋酸钠溶液及100ml 乙醇。临用前配制，或保存在棕色瓶中，可用数日。 还原液：5g碘化钾，5g硫代硫酸钠溶于100mL蒸馏水中，加150mL95%乙醇及2.5mL 2 mol/LHC1。现配现用. 亚流移品红液.2。减性品红溶解于400mL沸水中，冷知至50℃过滤。在滤液中加入 10mL2mo0L盐酸和4g偏亚硫酸钾(KS,0s),将 塞紧放在冰箱中过夜， 加g活性炭 过滤，再逐渐加入2molL盐酸，直至此溶液在玻片上干后不变红色为止，保存在棕色瓶中， 冰箱贮存，当溶液变红时不可以再用
或 7%醋酸中洗四次，每次 5min，于 90℃放置 15min。 （2）聚丙烯酰胺凝胶也可同上处理。在酸性醇溶液中，考马斯亮蓝-兼性离子载体络合 物溶解度显著增大，因此能免去清除兼性离子载体的步骤。可运用下列方法之一： 凝胶用 10%三氯醋酸固定，在 10%三氯醋酸-1%考马斯亮蓝 R250（19＋1）中室温染色 0.5h，用 10%三氯醋酸脱底色。 凝胶浸入预热至 60℃的 0.1%考马斯亮蓝固定染色液（150g 三氯醋酸，45g 磺基水杨酸 溶于 375mL 甲醇和 930mL 蒸馏水的混合液。每 1g 考马斯亮蓝 R250 溶于此混合液 1000mL 中）中约 30min，用酸性乙醇漂洗液（乙醇+水+冰醋酸=25+25+8）洗尽背景颜色。染色后 凝胶保存于酸性乙醇漂洗液中。本法灵敏度：卵清蛋白 0.03μg，血清清蛋白 0.02μg，血红 蛋白 0.01μg。 凝胶浸入考马斯亮蓝固定染色液（2g 考马斯亮蓝 R250，溶于 100mL 蒸馏水中，加 2mol/L 硫酸 100mL，过滤除去沉淀，向清液中滴加 10mol/L KOH 至颜色从绿变蓝为止。量体积， 每 100mL 加入三氯醋酸 12g）中 1h，然后用蒸馏水洗净背景颜色或在 0.2%H2SO4 溶液中浸 泡片刻脱除背景颜色。染色后的凝胶保存于蒸馏水中。本法机制未明，起染色作用的可能不 是考马斯亮蓝本身，灵敏度不如上法。 考马斯亮蓝法灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于 SDS 电泳的微量蛋白质的染色。在 549nm 有最大吸收值，蛋白质在 1～10μg 呈线性关系。 4．酸性品红法 经电泳后滤纸置于 0.2%酸性品红溶液中（2g 酸性品红溶解于 500mL 甲醇，400mL 蒸 馏水和 100mL 冰醋酸中）加热染色 15min；取出后浸入醋酸甲醇溶液（500mL 甲醇，加 400mL 蒸馏水和 100mL 冰醋酸）15min；然后浸入 10%醋酸溶液，每次 20min，至背景无色为止。 若欲进行比色，可用 0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡 2h，在波长为 570nm 处比色。 5．氨基萘酚磺酸法 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露于空气中几分钟，或在 2mol/L HCl 中浸一下使表 层蛋白变性，再在 0.003%氨基萘酚磺酸的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）中染 3min，在 紫外光下可显黄绿色荧光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性 时，可先在 3mol/L HCl 中浸 2min 以上使蛋白质充分变性，再染色。 二、复合蛋白质的显色反应 1．糖蛋白的显色 (1)过碘酸-Schiff 氏试剂显色法： 试剂 过碘酸液：1.2g 过碘酸溶解于 30mL 蒸馏水中，加 15mL 0.2mol/L 醋酸钠溶液及 100mL 乙醇。临用前配制，或保存在棕色瓶中，可用数日。 还原液：5g 碘化钾，5g 硫代硫酸钠溶于 100mL 蒸馏水中，加 150mL95%乙醇及 2.5mL 2mol/LHCl。现配现用。 亚硫酸品红液：2g 碱性品红溶解于 400mL 沸水中，冷却至 50℃过滤。在滤液中加入 10mL 2mol/L 盐酸和 4g 偏亚硫酸钾（K2S2O5），将瓶塞紧放在冰箱中过夜，加 1g 活性炭， 过滤，再逐渐加入 2mol/L 盐酸，直至此溶液在玻片上干后不变红色为止，保存在棕色瓶中， 冰箱贮存，当溶液变红时不可以再用
亚硫酸盐冲洗液：1mL浓硫酸，0.4g偏亚硫酸钾加入到100mL水中， 显色北魔 将含有样品的滤纸浸在70%乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸5min,用70%乙醇 洗一次，在还原液中浸5~8min,再用70%乙醇洗一次，在亚硫酸品红液 浸2425min 用亚硫酸盐冲洗液洗三次，并用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑灰色的底 板上呈现紫红色。 (2)甲苯胺蓝(Toluidine blue)显色法： 试刻 试剂甲：1.2g过碘酸溶解在30mL蒸馏水中，加15mL0.5mol/L醋酸钠和100mL96%乙 醇。现配现用。试剂乙：100mL甲醇加20ml冰醋酸及80mL蒸馏水。试剂丙：溴水。试剂 丁：10gL甲苯胺蓝水溶液。试剂戊：40gL钼酸铵溶液。 显色步骤 将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸15mim,试剂丙中浸15mi ,用自来水漂洗，再在 试剂丁中浸30min 来水中漂洗至没有蓝色染料渗出（约30 再依次在试剂 戊中浸3min,试剂乙中浸l5min,丙酮中浸2min后在空气中干燥。显色结果：糖蛋白部分 染成蓝色，背景带有红紫色。 (3)阿尔新蓝(Alcian blue)显色法： 聚丙烯酰胺凝胶在12.5%三氯醋酸中固定30min后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入1%过 镇酸液（在3%酸中）中氧化50min.用蒸馏水反复洗涤去除多余 的过碘酸盐。再放入0.59 偏重亚硫酸钾中还原剩余的过碘酸盐30min,再用蒸馏水洗涤。浸在0.5%阿尔新蓝（在3% 醋酸中)溶液中染4h。 2,酯蛋白的显色 (I)苏丹黑(Sudan black显色法 将0.1g苏丹黑B溶解于煮涕的100mL60%的乙醇溶液中，制备成饱和溶液，冷却后过 滤两次，备用。 显色时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，3h后取出，用50%乙醇溶液洗涤两次，每 次l5min,空气中干燥。 聚丙烯酰胺凝胶申泳中预染法：加苏丹黑B到无水乙醇中成饱和液，并震摇使乙酰化 用前过滤。按样品液的110量加入样品液中染色1h或4℃过夜。染色后的样品再进行电泳 (2)油红-0(O0i1redO)显色法： 0.04g油红溶解于100ml.60%的乙醇中，30℃放置过夜(16h)使充分饱和后，在30℃ 下滤去多余的染料，澄清液即可用于染色。 将滤纸浸入染料液中，在30℃下染色18h后，用水冲洗，使背景变浅，在空气中干燥。 脂蛋白为红色，背景为桃红色。本法在30℃以下显色时，会引起染料沉淀 第三节蛋白质的定量测定 “、凯氏定氮法 新鲜食品中含氮化合物大都以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往只限于 测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动
亚硫酸盐冲洗液： 1mL 浓硫酸，0.4g 偏亚硫酸钾加入到 100mL 水中。 显色步骤 将含有样品的滤纸浸在 70%乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸 5min，用 70%乙醇 洗一次，在还原液中浸 5～8min，再用 70%乙醇洗一次，在亚硫酸品红液中浸 24～25min, 用亚硫酸盐冲洗液洗三次，并用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑灰色的底 板上呈现紫红色。 （2）甲苯胺蓝（Toluidine blue）显色法： 试剂 试剂甲：1.2g 过碘酸溶解在 30mL 蒸馏水中，加 15mL 0.5mol/L 醋酸钠和 100mL 96%乙 醇。现配现用。试剂乙：100mL 甲醇加 20mL 冰醋酸及 80mL 蒸馏水。试剂丙：溴水。试剂 丁：10g/L 甲苯胺蓝水溶液。试剂戊：40g/L 钼酸铵溶液。 显色步骤 将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸 15min，试剂丙中浸 15min，用自来水漂洗，再在 试剂丁中浸 30min，自来水中漂洗至没有蓝色染料渗出（约 30～40min）后，再依次在试剂 戊中浸 3min，试剂乙中浸 15min，丙酮中浸 2min 后在空气中干燥。显色结果：糖蛋白部分 染成蓝色，背景带有红紫色。 （3）阿尔新蓝（Alcian blue ）显色法： 聚丙烯酰胺凝胶在 12.5%三氯醋酸中固定 30min 后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入 1%过 碘酸液（在 3%醋酸中）中氧化 50min。用蒸馏水反复洗涤去除多余的过碘酸盐。再放入 0.5% 偏重亚硫酸钾中还原剩余的过碘酸盐 30min，再用蒸馏水洗涤。浸在 0.5%阿尔新蓝（在 3% 醋酸中）溶液中染 4h。 2．脂蛋白的显色 （1）苏丹黑（Sudan black）显色法： 将 0.1g 苏丹黑 B 溶解于煮沸的 100mL 60%的乙醇溶液中，制备成饱和溶液，冷却后过 滤两次，备用。 显色时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，3h 后取出，用 50%乙醇溶液洗涤两次，每 次 15min，空气中干燥。 聚丙烯酰胺凝胶电泳中预染法：加苏丹黑 B 到无水乙醇中成饱和液，并震摇使乙酰化。 用前过滤。按样品液的 1/10 量加入样品液中染色 1h 或 4℃过夜。染色后的样品再进行电泳。 （2）油红-O（Oil red O）显色法： 0.04g 油红溶解于 100mL60%的乙醇中，30℃放置过夜（16h）使充分饱和后，在 30℃ 下滤去多余的染料，澄清液即可用于染色。 将滤纸浸入染料液中，在 30℃下染色 18h 后，用水冲洗，使背景变浅，在空气中干燥。 脂蛋白为红色，背景为桃红色。本法在 30℃以下显色时，会引起染料沉淀。 第三节 蛋白质的定量测定 一、凯氏定氮法 新鲜食品中含氮化合物大都以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往只限于 测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动