实验(二)沉淀反应定量法 实验目的:测定抗血清中特异性抗体的浓度。 二.器材与试剂: 1.37℃恒温箱 2.紫外分光光度计 3.冰箱 4.塑料离心管(15ml) 5.抗原(小牛血清) 6.免疫血清 7.pH7.2磷酸缓冲生理盐水(PBS) 8.0.1M NaOH 9.高速离心机 实验方法 在10支塑料离心管里分别加入1,10,20,50,100,150,250,350,450μl的抗原溶 液,用PBS将每支离心管里的溶液总量加至450μu。然后分别向各支离心管里再加入10oul 的抗血清,充分混合后在37℃的恒温箱内保温一小时,再在4℃的冰箱内放一夜。通过离心 (1000pm,20分钟)将沉淀和上清分开。将沉淀用冰冷的缓冲液洗涤三次后加入1ml0.M NaOH使之溶解,然后用紫外分光光度计测定A28nm处的光吸收 四数据处理 以抗体和牛血清白蛋白在A28=1.0时浓度分别为0695和1.886mg/ml计算,作出以抗 原量为Ⅹ轴,沉淀的总蛋白量为Y轴的沉淀曲线图。通过从图中最高值中减去抗原的量计 算出抗血清中特异的抗体的含量
269 实验(二) 沉淀反应定量法 一．实验目的：测定抗血清中特异性抗体的浓度。 二．器材与试剂: 1．37℃恒温箱 2．紫外分光光度计 3．冰箱 4．塑料离心管（15ml） 5．抗原（小牛血清） 6．免疫血清 7．pH 7.2 磷酸缓冲生理盐水（PBS） 8．0.1M NaOH 9．高速离心机 三．实验方法 在 10 支塑料离心管里分别加入 1，10，20，50，100，150，250，350，450l 的抗原溶 液，用 PBS 将每支离心管里的溶液总量加至 450l 。然后分别向各支离心管里再加入 100l 的抗血清，充分混合后在 37℃的恒温箱内保温一小时，再在 4℃的冰箱内放一夜。通过离心 （10000rpm，20 分钟）将沉淀和上清分开。将沉淀用冰冷的缓冲液洗涤三次后加入 1ml 0.1M NaOH 使之溶解，然后用紫外分光光度计测定 A280nm 处的光吸收。 四.数据处理 以抗体和牛血清白蛋白在 A280=1.0 时浓度分别为 0.695 和 1.886mg/ml 计算，作出以抗 原量为 X 轴，沉淀的总蛋白量为 Y 轴的沉淀曲线图。通过从图中最高值中减去抗原的量,计 算出抗血清中特异的抗体的含量
实验(三)双向免疫扩散法 双向扩散法( double diffusion)又称琼脂扩散法,是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反 应,扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇,形成抗原一抗体复合物,比例合适时将出 现沉淀现象 实验目的:测定免疫血清的效价 器材与试剂 载玻片 打孔器 3.微量取液器 4.稀释板 5.培养器或带盖培养皿 6.抗原 7.免疫血清(抗血清) 8.琼脂糖(或进口分装琼脂粉) 9.pH72磷酸缓冲生理盐水(PBS)100ml 实验方法 1.琼脂凝胶板的制作 称取6g琼脂粉放入三角瓶中,加入50 ImI PBS,加热溶解成12%的琼脂溶液(冬天则 琼脂的浓度为1%),用5~10ml小量筒量取4ml倾入洁净水平放置的载玻片中,凝固后用打 孔器按图1打孔。 2.抗血清的稀释 采用二倍连续稀释法,先在稀释板的六个孔里加100μd的PBS,然后取等量的抗血清与 第一孔里的PBS混合,从第一孔里吸取100μd加入第二孔中,充分混合,依次类推从而得
270 实验(三) 双向免疫扩散法 双向扩散法（double diffusion）又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反 应，扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原—抗体复合物，比例合适时将出 现沉淀现象。 一. 实验目的：测定免疫血清的效价 二. 器材与试剂 1. 载玻片 2. 打孔器 3. 微量取液器 4. 稀释板 5. 培养器或带盖培养皿 6. 抗原 7. 免疫血清（抗血清） 8. 琼脂糖（或进口分装琼脂粉） 9. pH 7.2 磷酸缓冲生理盐水（PBS）100ml 三. 实验方法 1. 琼脂凝胶板的制作 称取 0.6g 琼脂粉放入三角瓶中，加入 50ml PBS, 加热溶解成 1.2%的琼脂溶液（冬天则 琼脂的浓度为 1%），用 5~10ml 小量筒量取 4ml 倾入洁净水平放置的载玻片中，凝固后用打 孔器按图 1 打孔。 2. 抗血清的稀释 采用二倍连续稀释法，先在稀释板的六个孔里加 100l 的 PBS，然后取等量的抗血清与 第一孔里的 PBS 混合，从第一孔里吸取 100l 加入第二孔中，充分混合，依次类推从而得
到2倍,4倍,8倍……,即2的释释血清。 3.免疫双扩散 按照抗血清稀释倍数的顺序用微量取液器依次取一定量的稀释抗血清加在琼脂板上外 周的孔内(充满平),然后在中心的孔里加入抗原,加样完毕后把琼脂板放入湿润密闭的培 养皿中放置24-48小时即可观察到沉淀线 免疫血清效价的判断方法,就是能够观察到沉淀线的免疫血清的最大稀释倍数,称为免 疫血清的效价 实验(四)对流免疫电泳 对流免疫电泳( counter immunoelectrophoresis)通过外加电场以限制抗原、抗体的自由 扩散,提高抗原、抗体的局部浓度,加快两者的移动速度。由于血清抗原在碱性缓冲液中 (pH8.6)带负电荷,由负极向正极移动,血清抗体由于接近等电点,由正极向负极渗透(电 渗效应),比例合适时,二者相遇形成白色沉淀线。此法可定性或定量 实验目的:学习快速测定免疫效价的方法。 二.器材与试剂 1.电泳仪 2.平板电泳槽 3.pH86电板缓冲液(巴比妥缓冲液)离子强度0.05μ。取巴比妥(Mw18419)1.84g 巴比妥钠(Mw.20620)10.3g溶于蒸馏水,定溶至1升。这是电泳槽用液。制备琼脂溶液 时需要将上述缓冲稀释一倍,离子强度为0.025μ。 其它器材和试剂同实验三。 三.实验方法 1.铺制琼脂板 用离子强度μ=0.025的巴比妥缓冲液配制琼脂溶液20m,按双向免疫扩散法中描述的 方法铺制琼脂板,按图2打孔
271 到 2 倍，4 倍，8 倍……，即 2 n 的释释血清。 3. 免疫双扩散 按照抗血清稀释倍数的顺序用微量取液器依次取一定量的稀释抗血清加在琼脂板上外 周的孔内（充满平），然后在中心的孔里加入抗原，加样完毕后把琼脂板放入湿润密闭的培 养皿中放置 24-48 小时即可观察到沉淀线。 免疫血清效价的判断方法，就是能够观察到沉淀线的免疫血清的最大稀释倍数，称为免 疫血清的效价。 实验(四) 对流免疫电泳 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis）通过外加电场以限制抗原、抗体的自由 扩散，提高抗原、抗体的局部浓度，加快两者的移动速度。由于血清抗原在碱性缓冲液中 （pH8.6）带负电荷，由负极向正极移动，血清抗体由于接近等电点，由正极向负极渗透（电 渗效应），比例合适时，二者相遇形成白色沉淀线。此法可定性或定量。 一. 实验目的：学习快速测定免疫效价的方法。 二. 器材与试剂 1. 电泳仪 2. 平板电泳槽 3. pH 8.6 电板缓冲液（巴比妥缓冲液）离子强度 0.05。取巴比妥（MW184.19）1.84g, 巴比妥钠（M.W.206.20）10.3g 溶于蒸馏水，定溶至 1 升。这是电泳槽用液。制备琼脂溶液 时需要将上述缓冲稀释一倍，离子强度为 0.025。 其它器材和试剂同实验三。 三. 实验方法 1. 铺制琼脂板 用离子强度 =0.025 的巴比妥缓冲液配制琼脂溶液 20ml，按双向免疫扩散法中描述的 方法铺制琼脂板，按图 2 打孔
图2 AgO○OO 2.加样 在靠正极的孔内加稀释抗体,在靠负板的孔内加抗原。 3.电泳 在平板电泳槽里倒进离子强度μ=0.05的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔 板上。琼脂的两端用浸温的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相连接,抗体端接正极。通电, 电流强度按琼脂板的宽度计算(1-2mAcm)。观察到白色沉淀线时,即电泳完毕(一般1小 时左右)。 可快速测定抗体效价 实验(五)微量免疫电泳 免疫电泳法( immunoelectrophoresis)是把蛋白质电泳分离技术(琼脂电泳)和免疫学 检测技术(双向扩散)结合起来的检测方法。此法在微量的基础上具有分辨率高,灵敏度高 时间短,是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的方法。用于抗原、抗体定性及纯度的测定 在临床诊断方面也有应用价值 一.实验目的 学习凝胶内分离蛋白质的电泳技术与利用抗原抗体的特异性反应的免疫扩散技术结合 起来,分析鉴定抗原或者抗体的免疫化学方法。 二.器材及试剂 1.指示蛋白:溴酚蓝染色的牛血清白蛋白 2.切割琼脂板的小刀 3.牙签
272 2. 加样 在靠正极的孔内加稀释抗体，在靠负板的孔内加抗原。 3. 电泳 在平板电泳槽里倒进离子强度=0.05 的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔 板上。琼脂的两端用浸温的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相连接，抗体端接正极。通电， 电流强度按琼脂板的宽度计算（1-2mA/cm）。观察到白色沉淀线时，即电泳完毕（一般 1 小 时左右）。 可快速测定抗体效价。 实验(五) 微量免疫电泳 免疫电泳法（immunoulectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学 检测技术（双向扩散）结合起来的检测方法。此法在微量的基础上具有分辨率高，灵敏度高， 时间短，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的方法。用于抗原、抗体定性及纯度的测定。 在临床诊断方面也有应用价值。 一. 实验目的 学习凝胶内分离蛋白质的电泳技术与利用抗原抗体的特异性反应的免疫扩散技术结合 起来,分析鉴定抗原或者抗体的免疫化学方法。 二. 器材及试剂 1. 指示蛋白：溴酚蓝染色的牛血清白蛋白 2. 切割琼脂板的小刀 3. 牙签
4.其它的器材与试剂同实验四 三.实验方法 1.琼脂板的铺制 如实验四铺好琼脂板,然后按图3的图样打孔划槽,电泳时不要把槽中的琼脂挑岀来(槽 的二竖边先不划开) 图3 Ab 溴酚兰+BSA 2.加样 使琼脂板的上孔里充满抗原溶液,下孔里充满着指示蛋白。 3.电泳 如实验四的操作方法,调电流强度为2~4mAcm。当指示蛋白质到达滤纸的边缘时就可 以停止电泳。一般需要40~60分钟。 4.扩散 电泳结束后,从琼脂板中间的槽里用牙签挑出琼脂凝胶,并加入免疫血清。将琼脂板置 温盒内(或培养皿中),盖好盖子放置一夜。次日可以观察到凝胶内出现的沉淀线。一般情 况下每一沉淀线即代表一种抗原成分。根据沉淀的数量位置可以判断抗原的纯度以及抗原 蛋白质的种类。微量免疫电泳常用于分析样品的血清成分 5.观察 免疫电泳的图谱可以直接观察到抗原抗体沉淀线,也可以用0.1%的氨基黑染色后观察。 如果需要保存了的话可以拍照
273 4. 其它的器材与试剂同实验四 三. 实验方法 1. 琼脂板的铺制 如实验四铺好琼脂板，然后按图 3 的图样打孔划槽，电泳时不要把槽中的琼脂挑出来（槽 的二竖边先不划开）。 2. 加样 使琼脂板的上孔里充满抗原溶液，下孔里充满着指示蛋白。 3. 电泳 如实验四的操作方法，调电流强度为 2~4mA/cm。当指示蛋白质到达滤纸的边缘时就可 以停止电泳。一般需要 40~60 分钟。 4. 扩散 电泳结束后，从琼脂板中间的槽里用牙签挑出琼脂凝胶，并加入免疫血清。将琼脂板置 温盒内（或培养皿中），盖好盖子放置一夜。次日可以观察到凝胶内出现的沉淀线。一般情 况下每一沉淀线即代表一种抗原成分。根据沉淀的数量.位置可以判断抗原的纯度以及抗原 蛋白质的种类。微量免疫电泳常用于分析样品的血清成分。 5. 观察 免疫电泳的图谱可以直接观察到抗原抗体沉淀线，也可以用 0.1%的氨基黑染色后观察。 如果需要保存了的话可以拍照