紫外分光光度法测定蛋白质含量 【实验目的】 1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验 技术和使用方法。 【实验原理】 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭 双键,所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外 吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大 吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,因此可作蛋 白质定量分析
二、紫外分光光度法测定蛋白质含量 【实验目的】 1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验 技术和使用方法。 【实验原理】 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭 双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外 吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大 吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋 白质定量分析
利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅 速,简便,不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定,因 此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是: 对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定 误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干 扰,此时必须同时测定260和280nm吸光度,通过公 式校正测定,以消除核酸的影响,而推算处蛋白质浓 度 不同蛋白质和核酸吸收是不同的,即使校正也存 在误差,但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的 浓度范围为01-10mgmL
利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅 速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因 此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是： 对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定 误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干 扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公 式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓 度。 不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存 在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的 浓度范围为0.1—1.0mg/mL
【仪器与试剂】 1.紫外分光光度计,比色管(10m的5个), 吸量管。 2.标准蛋白质溶液:0.9%NaC溶液溶解 025g结晶牛血清白蛋白,稀释到250ml 3.待测蛋白溶液:用酪蛋白配制,浓度在10 2.5mg/ml 4.0.9%Nac|溶液 5.试管1.5cm×15cm(×9) 6.移液管1m(×3),2m(×2),5ml (×2)
【仪器与试剂】 1. 紫外分光光度计，比色管（10ml的5个）， 吸量管。 2. 标准蛋白质溶液：0.9% NaCl溶液溶解 0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。 3. 待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在1.0- 2.5mg/ml 4. 0.9% NaCl溶液 5. 试管1.5cm×15cm（×9） 6. 移液管1ml（×3），2ml（×2），5ml （×2）
【实验步骤】 1、标准曲线法 (1)标准曲线的制作:取8只试管按表25加入试剂,摇 匀。选择光程1cm石英比色皿,在280nm波长测定A280, 以A280值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。 表12紫外分光光度法测定蛋白质浓度标准曲线的绘制 项目 2 3 5 6 78 标准蛋白液m00.5101.520253040 蒸馏水/ml 4.0353.02.52.01.51.00 蛋白质浓度m001250.250.3750.5006250.751.0 A280
【实验步骤】 1、标准曲线法 （1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇 匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280， 以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 项 目 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度/ml 0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0 A280 表1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制
(2)样品测定: 配制待测蛋白质溶液1ml,加入蒸馏水3ml,摇 匀,测定A280,从标准曲线中查出蛋白质浓度。 2.直接测定法 在紫外分光光度计上,将待测蛋白质溶液加入 比色皿,以生理盐水为对照,测定280nm和260m 波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度: 蛋白质浓度(mgmL)=145A280-074A260 (C为蛋白质浓度,mgm,A280和A260分别为 蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)
（2）样品测定： 配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇 匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 2. 直接测定法 在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入 比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm 波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为 蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)