③静置 2 分钟便可在 400~600 倍的显微镜下检查。 ④计算计数室的四角及中央共五个中方格即 80 个小方格内的精子数。 ⑤计算每小格内的精子，只数格内及压在左线和上线者。 ⑥由五个中方格(80 个小方格)所数到的精子数代入下式即得出每毫升的精子数。 每毫升内所含精子数=5 个中方格内的精子数×400×10×1000×稀释倍数（确定精液稀 释倍数时可按表 2 计算） 为了减少误差，必须进行两次计数，如果前后两次误差大于10％，应作第三次检 查。最后在三次检查中取两次误差不超过10％，求出平均数，即为所确定的精子数。 2.血球吸管计算 介绍血球吸管的构造及各种家畜应该使用何种血球吸管（红血球吸管 或白血球吸管）。由于同学们在学习生理时已熟悉有关血细胞计数室的运用，故不再详述它的 结构。 （1）清洗器械 吸 管：自来水 蒸馏水 95％酒精 乙醚 计数室：自来水 蒸馏水 白稠布擦干净备用 （2）精液稀释 ①牛、羊、鸡的精液（密度高）用红血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸 3% NaCl 至“101”刻度，为稀释 200 倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸 3% NaCl 至 “101”刻度，则为稀释 100 倍。 ②猪、马、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸 3% NaCl 至“11”刻度，为稀释 20 倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸 3% NaCl 至“11” 刻度，则为稀释 10 倍。 （3）精子的计数 ①将计数室推上盖玻片。要求盖玻片被推上后以立起计数室不掉下来为原则，并且盖玻 片在折光时可见到清晰的彩色条纹。 ②将盖好盖玻片的计数室置于低倍镜下观察，首先要求找到清晰的计数室。 ③用血球吸管吸精液，用药棉擦去吸管尖端外围附着的精液，并用 3% NaCl 稀释，因不 同的家畜用不同的吸管稀释。 ④吸管吸好精液和 3% NaCl 以后，用拇指及食指堵住吸管两端进行来回的充分摇动混匀。 然后弃去吸管中的前 2 滴，再将吸管尖端置于血球计数室和盖玻片交界处的边缘上，吸管内
③静置 2 分钟便可在 400~600 倍的显微镜下检查。 ④计算计数室的四角及中央共五个中方格即 80 个小方格内的精子数。 ⑤计算每小格内的精子，只数格内及压在左线和上线者。 ⑥由五个中方格(80 个小方格)所数到的精子数代入下式即得出每毫升的精子数。 每毫升内所含精子数=5 个中方格内的精子数×400×10×1000×稀释倍数（确定精液稀 释倍数时可按表 2 计算） 为了减少误差，必须进行两次计数，如果前后两次误差大于10％，应作第三次检 查。最后在三次检查中取两次误差不超过10％，求出平均数，即为所确定的精子数。 2.血球吸管计算 介绍血球吸管的构造及各种家畜应该使用何种血球吸管（红血球吸管 或白血球吸管）。由于同学们在学习生理时已熟悉有关血细胞计数室的运用，故不再详述它的 结构。 （1）清洗器械 吸 管：自来水 蒸馏水 95％酒精 乙醚 计数室：自来水 蒸馏水 白稠布擦干净备用 （2）精液稀释 ①牛、羊、鸡的精液（密度高）用红血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸 3% NaCl 至“101”刻度，为稀释 200 倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸 3% NaCl 至 “101”刻度，则为稀释 100 倍。 ②猪、马、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸 3% NaCl 至“11”刻度，为稀释 20 倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸 3% NaCl 至“11” 刻度，则为稀释 10 倍。 （3）精子的计数 ①将计数室推上盖玻片。要求盖玻片被推上后以立起计数室不掉下来为原则，并且盖玻 片在折光时可见到清晰的彩色条纹。 ②将盖好盖玻片的计数室置于低倍镜下观察，首先要求找到清晰的计数室。 ③用血球吸管吸精液，用药棉擦去吸管尖端外围附着的精液，并用 3% NaCl 稀释，因不 同的家畜用不同的吸管稀释。 ④吸管吸好精液和 3% NaCl 以后，用拇指及食指堵住吸管两端进行来回的充分摇动混匀。 然后弃去吸管中的前 2 滴，再将吸管尖端置于血球计数室和盖玻片交界处的边缘上，吸管内
的精液自动渗入计数室内，使之自然、均匀地分充满计数室。注意不要使精液溢出盖玻片， 也不可因精液不足而使计数室内有气泡或干燥处，否则，应重新操作。静放 2 分钟，开始计 数。 ⑤移到高倍镜下镜检和计数。首先数出四角和正中间的五个中方格中的精子数，也就是 80 个小方格中的精子数。载物台要平置，不能斜放，光线不必过强。计数时先数出四个角及 中央的五个中方格中的精子数，然后用下列公式计算。重复次数同前。 每毫升原精液内的精子数=5 个中方格内的精子数×5×10×1000×稀释倍数× X（如果 是原精液不要דX”） 表 2 血吸管或红、白血球吸管稀释精液的倍数 精 液 稀释管种类 吸取时所达到的刻度 稀释倍数 精 液 3％NaCl 牛 羊 红血球吸管 0.5 101 200 1 101 100 血 吸 管 10 µl 199 µl 200 20 µl 1980 µl 100 猪 马 白血球吸管 0.5 11 20 1 11 10 血 吸 管 10 µl 190 µl 20 20 µl 180 µl 10 四、实验报告 写出所得实 验 结 果。 实验六 精子形态和畸形率的测定 一、目的和要求 由于所需时间等原因，无需对每次采精进行精子畸形率的测定。但应当每月对每一头种 公畜进行一次畸形率的测定，以绘出精子畸形率变化图。畸形率突然增高，表明存在问题， 应当查找和分析原因。畸形率在 20％以内，牛 18％，羊 14％，猪 18％，马 12％以下时受精 力一般不受影响。畸形精子一般不表现前进运动，因而随着畸形精子数增多，精子活率下降。 如在检查精子运动力时，可观察到许多畸形精子，也需要进一步作形态学检查。 通过本实验，了解家畜精液中精子形态与精液品质的关系，掌握精子形态的分类和分析 方法
的精液自动渗入计数室内，使之自然、均匀地分充满计数室。注意不要使精液溢出盖玻片， 也不可因精液不足而使计数室内有气泡或干燥处，否则，应重新操作。静放 2 分钟，开始计 数。 ⑤移到高倍镜下镜检和计数。首先数出四角和正中间的五个中方格中的精子数，也就是 80 个小方格中的精子数。载物台要平置，不能斜放，光线不必过强。计数时先数出四个角及 中央的五个中方格中的精子数，然后用下列公式计算。重复次数同前。 每毫升原精液内的精子数=5 个中方格内的精子数×5×10×1000×稀释倍数× X（如果 是原精液不要דX”） 表 2 血吸管或红、白血球吸管稀释精液的倍数 精 液 稀释管种类 吸取时所达到的刻度 稀释倍数 精 液 3％NaCl 牛 羊 红血球吸管 0.5 101 200 1 101 100 血 吸 管 10 µl 199 µl 200 20 µl 1980 µl 100 猪 马 白血球吸管 0.5 11 20 1 11 10 血 吸 管 10 µl 190 µl 20 20 µl 180 µl 10 四、实验报告 写出所得实 验 结 果。 实验六 精子形态和畸形率的测定 一、目的和要求 由于所需时间等原因，无需对每次采精进行精子畸形率的测定。但应当每月对每一头种 公畜进行一次畸形率的测定，以绘出精子畸形率变化图。畸形率突然增高，表明存在问题， 应当查找和分析原因。畸形率在 20％以内，牛 18％，羊 14％，猪 18％，马 12％以下时受精 力一般不受影响。畸形精子一般不表现前进运动，因而随着畸形精子数增多，精子活率下降。 如在检查精子运动力时，可观察到许多畸形精子，也需要进一步作形态学检查。 通过本实验，了解家畜精液中精子形态与精液品质的关系，掌握精子形态的分类和分析 方法
二、材料和器械 （一）材料 牛、羊、猪或兔等任何一种家畜的新鲜精液或冷冻精液 （二）器械 高倍显微镜，计数器，载玻片，盖玻片 （三）药品 0.5％龙胆紫酒精溶液 三、内容和步骤 畸形精子形态可分为头部畸形、尾部畸形和中段畸形三类。头部畸形的精子包括：窄头、 头基部狭窄、梨形头、圆头、巨头、小头、头基部过宽、双头、顶部脱落等；尾部畸形精子 包括：带原生质滴的精子（近端、远端）、无头的尾（它和无尾的头往往是一个精子的两部分， 在分析时一般算作尾部的畸形）、单卷尾、多重卷尾、环形卷尾、双尾等；中段畸形的精子包 括：颈部肿胀、中段纤丝裸露、中段呈螺旋状、双中段等。 （一）精子头部形态的观察（采用威廉氏染色法） 1.染料的制备 复红原液的配制：10 g 复红溶于 100 ml 95％的酒精中 复红染色液：复红原液 10 ml +100 ml 5％的石碳酸(苯酚) 饱和伊红酒精溶液：1 g 伊红溶于 95％的酒精 美蓝溶液：10 g 美蓝 + 1000 ml 96％的酒精 美蓝染色液：30 ml 美蓝溶液＋l00 m1 0.01％ KOH 过滤后再加入 3 倍量的蒸馏水混合后 即可使用。 2.染色程序 ①先制作精液抹片，要求薄而均匀。然后风干或用酒精灯火焰固定。 ②浸入无水酒精中固定 2~3 min，取出风干。 ③浸入 0.5％氯胺 T 中 l~2 min。 ④用清水洗 1~2 min。 ⑤迅速通过 96％的酒精，风干。 ⑥放人石碳酸复红染色液中 l0~15 min，然后清水中蘸 2 次。 ⑦迅速通过美蓝染色液。 ⑧水洗后风干 经此方法染色后，精子头部呈淡红色，中段及尾部为暗红色，头部轮廓清晰。可在高倍
二、材料和器械 （一）材料 牛、羊、猪或兔等任何一种家畜的新鲜精液或冷冻精液 （二）器械 高倍显微镜，计数器，载玻片，盖玻片 （三）药品 0.5％龙胆紫酒精溶液 三、内容和步骤 畸形精子形态可分为头部畸形、尾部畸形和中段畸形三类。头部畸形的精子包括：窄头、 头基部狭窄、梨形头、圆头、巨头、小头、头基部过宽、双头、顶部脱落等；尾部畸形精子 包括：带原生质滴的精子（近端、远端）、无头的尾（它和无尾的头往往是一个精子的两部分， 在分析时一般算作尾部的畸形）、单卷尾、多重卷尾、环形卷尾、双尾等；中段畸形的精子包 括：颈部肿胀、中段纤丝裸露、中段呈螺旋状、双中段等。 （一）精子头部形态的观察（采用威廉氏染色法） 1.染料的制备 复红原液的配制：10 g 复红溶于 100 ml 95％的酒精中 复红染色液：复红原液 10 ml +100 ml 5％的石碳酸(苯酚) 饱和伊红酒精溶液：1 g 伊红溶于 95％的酒精 美蓝溶液：10 g 美蓝 + 1000 ml 96％的酒精 美蓝染色液：30 ml 美蓝溶液＋l00 m1 0.01％ KOH 过滤后再加入 3 倍量的蒸馏水混合后 即可使用。 2.染色程序 ①先制作精液抹片，要求薄而均匀。然后风干或用酒精灯火焰固定。 ②浸入无水酒精中固定 2~3 min，取出风干。 ③浸入 0.5％氯胺 T 中 l~2 min。 ④用清水洗 1~2 min。 ⑤迅速通过 96％的酒精，风干。 ⑥放人石碳酸复红染色液中 l0~15 min，然后清水中蘸 2 次。 ⑦迅速通过美蓝染色液。 ⑧水洗后风干 经此方法染色后，精子头部呈淡红色，中段及尾部为暗红色，头部轮廓清晰。可在高倍
镜或油镜下观察 200 个精子计算出各类头部畸形精子的比例。 畸形精子百分率＝畸形精子数/总精子数×100% （二）精子尾部形态的观察 1.福尔马林缓冲液的制备 将 21.82 g Na2HP04·2H20 和 22.25 g KH2P04 分别溶于 500 ml 蒸馏水中，然后取 200 ml Na2HP04 加 80 ml KH2PO4 配成缓冲液。再取该缓冲液 100 ml 加入 62．5 ml 40%（v/v）福尔马林溶液，最后加蒸馏水至 500 ml。 2.观察程序 ①l ml 玻璃管中装入一些福尔马林缓冲液，置于 37℃恒温箱中备用。 ②根据原精液的浓度，向装有福尔马林缓冲液的小玻璃管中滴 2~5 滴精液并混匀。 ③取一滴上述混合液置于载玻片上，加盖玻片静止数分钟后在 400 倍的相差显微镜下观 察精子尾部形态。随机观察 200 个精子计算各种尾部畸形精子所占的比例。 畸形精子百分率＝畸形精子数/总精子数×100% （三）非精子有形成分的观察（采用苏木精—伊红染色法） 非精子有形成分多为精子形成过程中的某些退化物、生殖上皮的脱落物和血细胞等。这 些成分在精液中出现的比例和类型在一定程度上能反映睾丸和精液排出管道的生理状态。在 精液中经常出现的非精子有形物有白细胞、红细胞和鳞状上皮细胞等。 1.染料的配制 苏木精染液：2 g 苏木精溶于 100 ml 无水酒精中，加入 100 ml 蒸馏水、100 ml 甘油、3 g 冰醋酸和 10 g 铝酸钾混合，放置 14 天后使用，用前需震荡。 伊红染液：l g 伊红溶于 100 ml 95％酒精，染色时取一定量的该溶液加入等量 70％的酒 精。 2.染色程序 ①先制备间断式的精液抹片（即当推制抹片时，不要一推到底，而要断续前推，使抹片 厚度有一个梯度变化，染色后易于观察不同类型的精子成分），然后风干。 ②浸入无水酒精中固定 3~5 min，风干。 ③分别浸入 95％的酒精、75％的酒精和蒸馏水中各 1 min。 ④浸入苏木精染色液中 5 min。 ⑤浸入伊红染色液中 l min。 ⑥冲洗 1~3 min
镜或油镜下观察 200 个精子计算出各类头部畸形精子的比例。 畸形精子百分率＝畸形精子数/总精子数×100% （二）精子尾部形态的观察 1.福尔马林缓冲液的制备 将 21.82 g Na2HP04·2H20 和 22.25 g KH2P04 分别溶于 500 ml 蒸馏水中，然后取 200 ml Na2HP04 加 80 ml KH2PO4 配成缓冲液。再取该缓冲液 100 ml 加入 62．5 ml 40%（v/v）福尔马林溶液，最后加蒸馏水至 500 ml。 2.观察程序 ①l ml 玻璃管中装入一些福尔马林缓冲液，置于 37℃恒温箱中备用。 ②根据原精液的浓度，向装有福尔马林缓冲液的小玻璃管中滴 2~5 滴精液并混匀。 ③取一滴上述混合液置于载玻片上，加盖玻片静止数分钟后在 400 倍的相差显微镜下观 察精子尾部形态。随机观察 200 个精子计算各种尾部畸形精子所占的比例。 畸形精子百分率＝畸形精子数/总精子数×100% （三）非精子有形成分的观察（采用苏木精—伊红染色法） 非精子有形成分多为精子形成过程中的某些退化物、生殖上皮的脱落物和血细胞等。这 些成分在精液中出现的比例和类型在一定程度上能反映睾丸和精液排出管道的生理状态。在 精液中经常出现的非精子有形物有白细胞、红细胞和鳞状上皮细胞等。 1.染料的配制 苏木精染液：2 g 苏木精溶于 100 ml 无水酒精中，加入 100 ml 蒸馏水、100 ml 甘油、3 g 冰醋酸和 10 g 铝酸钾混合，放置 14 天后使用，用前需震荡。 伊红染液：l g 伊红溶于 100 ml 95％酒精，染色时取一定量的该溶液加入等量 70％的酒 精。 2.染色程序 ①先制备间断式的精液抹片（即当推制抹片时，不要一推到底，而要断续前推，使抹片 厚度有一个梯度变化，染色后易于观察不同类型的精子成分），然后风干。 ②浸入无水酒精中固定 3~5 min，风干。 ③分别浸入 95％的酒精、75％的酒精和蒸馏水中各 1 min。 ④浸入苏木精染色液中 5 min。 ⑤浸入伊红染色液中 l min。 ⑥冲洗 1~3 min
⑦通过 70％和无水酒精，风干。 ⑧风干后用二甲苯加盖玻片封存。如不保存可直接观察。 经此方法染色后，细胞核染成蓝色，细胞质呈红色。在高倍镜(油镜)下观察各种非精子 有形成分的量，估计它们所占的比例。 四、实验报告 绘出你所观察到的各类畸形精子。 实验七 精子顶体染色观察 一、目的和要求 顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因它能释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的 粘合基质，使精子能够通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或 者不受精。精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏。精液冷冻解冻也会损伤一些精子，重要的 是要准确知道受伤精子百分数。优质奶牛精液冷冻前，约 90％精子具有完整的顶体。冷冻后 下降至 60％～65％。研究表明，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间的相 关性更强。因而，检查精子顶体完整率很重要。 本实验二人一组，要求学生学会精液抹片染色技术及比较正常精子顶体和异常精子顶体 形态，计算精子顶体完整率。 二、材料和仪器 （一）材料 精液 （二）器材 酒精棉球，擦镜纸，移液枪，玻璃滴管，小镊子，pH 试纸，玻璃棒，烧杯， 小搪瓷盘，染色缸，卫生纸，玻璃平皿，切片盒，血球计数器，显微镜，镊子 （三）药品 Na2HPO4·12H2O ，NaH2PO4·2H2O，生理盐水，甲醛，MgCO3 三、内容和步骤 （一）试剂的配制 1．磷酸盐缓冲液 Na2HPO4·12H2O 2.2 g NaH2PO4·2H2O 0.55 g
⑦通过 70％和无水酒精，风干。 ⑧风干后用二甲苯加盖玻片封存。如不保存可直接观察。 经此方法染色后，细胞核染成蓝色，细胞质呈红色。在高倍镜(油镜)下观察各种非精子 有形成分的量，估计它们所占的比例。 四、实验报告 绘出你所观察到的各类畸形精子。 实验七 精子顶体染色观察 一、目的和要求 顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因它能释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的 粘合基质，使精子能够通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或 者不受精。精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏。精液冷冻解冻也会损伤一些精子，重要的 是要准确知道受伤精子百分数。优质奶牛精液冷冻前，约 90％精子具有完整的顶体。冷冻后 下降至 60％～65％。研究表明，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间的相 关性更强。因而，检查精子顶体完整率很重要。 本实验二人一组，要求学生学会精液抹片染色技术及比较正常精子顶体和异常精子顶体 形态，计算精子顶体完整率。 二、材料和仪器 （一）材料 精液 （二）器材 酒精棉球，擦镜纸，移液枪，玻璃滴管，小镊子，pH 试纸，玻璃棒，烧杯， 小搪瓷盘，染色缸，卫生纸，玻璃平皿，切片盒，血球计数器，显微镜，镊子 （三）药品 Na2HPO4·12H2O ，NaH2PO4·2H2O，生理盐水，甲醛，MgCO3 三、内容和步骤 （一）试剂的配制 1．磷酸盐缓冲液 Na2HPO4·12H2O 2.2 g NaH2PO4·2H2O 0.55 g