35.2 46.3 7.0 57.7 84 31.6 7.4 22.6 15 932 ※:用蒸馏水将混合的两种1moL贮存液稀释至100ml,根据 Henderson- Hasselbalch方程计算其pH 值: pl=pK+lg(质子受体]质子供体 在此,pK=6.86(25℃) 测序凝胶加样缓冲液 98%去离子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚蓝
6.2 17.8 82.2 6.4 25.5 74.5 6.6 35.2 64.8 6.8 46.3 53.7 7.0 57.7 42.3 7.2 68.4 31.6 7.4 77.4 22.6 7.6 84.5 15.5 7.8 89.6 10.4 8.0 93.2 6.8 ※:用蒸馏水将混合的两种 1mol/L 贮存液稀释至 1000ml，根据 Henderson-Hasselbalch 方程计算其 pH 值： pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体]) 在此，pK’=6.86(25℃)。 3．电泳缓冲液 测序凝胶加样缓冲液 98%去离子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青 FF 0.025%溴酚蓝
甲酰胺:许多批号的试剂级甲酰胺,其纯度符合使用要求,无须再进行处理。不过,一旦略呈黄色, 则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与 Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理,并用 Whatma n1号滤纸过滤2次,去离子甲酰胺分装成小份,充氮存于-70℃ 常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液(每升) Tris-乙酸(TAE) 1×:0.04 mol/L Tris-乙酸 0×:242gTrs碱 0. 001moLL EDTA 57lml冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸(TPE) 1×0.09 mol/L Tris-磷酸 10×:10 g Tris碱 0.002mOLL EDTA 15.5ml85%磷酸(1.679g/ml) 40ml 0. 5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸(TBE)a 0.5×0045 mol/L Tris-硼酸 5x:54 g Tris碱 0.00 1moI/L EDTA 27.5硼酸 20ml 0. 5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1×:50 mmol/L NaOH l×:5 ml 10mol NaoH I mmol/L EDTA 2ml 0. 5mmoML EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸 1×25 mmolL Tris 5×:15. Ig Tris 250mmL甘氨酸 94g苷氨酸(电泳级)(pH8.3) 0.1% SDS 5ml10%SDS(电泳级) ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉 淀后则予以废弃。 以片都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足 够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液
甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色， 则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与 Dowex XG8混合床树脂共同搅拌 1 小时进行去离子处理，并用 Whatma n 1 号滤纸过滤 2 次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。 常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris 碱 0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris 碱 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×：54g Tris 碱 0.001mol/L EDTA 27.5 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液 b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸 c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3） 0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级) 说明： ①TBE 溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存 5×溶液，出现沉 淀后则予以废弃。 以片都以 1×TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但 0.5×的使用液已具备足 够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以 1：10 稀释的贮存液作为使用液
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小,故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×BE以 提供足够的缓冲容量 ②碱性电泳缓冲液应现用现配 ③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2xSDS凝胶加样缓冲液 100mmol Tris. HCI(6. 8) 200mmoL二硫苏糖醇(DTT) 4%SDS(电泳级) 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,应在临用前取1moL贮存液现加于上述缓冲液中 4.凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6x缓冲液 贮存温度 025%溴酚蓝 025%二甲苯青FF 40%(w/V)蔗糖水溶液 025溴酚蓝 025%二甲苯青FF 室温 025%溴酚蓝 Ⅲ 025%二甲苯青FF 4℃
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1×TBE 以 提供足够的缓冲容量。 ②碱性电泳缓冲液应现用现配。 ③Tris-甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2×SDS 凝胶加样缓冲液： 100mmol/L Tris·HCl(6.8) 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含 DTT 的 2×SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取 1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。 4．凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青 FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25 溴酚蓝 室温 0.25%二甲苯青 FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 FF 4℃
30%甘油水溶液 025%溴酚蓝 40%(W/V)蔗糖水溶液 4℃ 碱性加样缓冲液 300mmolL NaoH 6mmol/L EDTa 18%聚蔗糖(Fcol400) 0.15%溴甲酚绿 025%二甲苯青FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度:以确保DNA均匀进入样品孔内:使样品呈现 颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移 动的速率约为二甲苯青FF的22倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的 泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。 在琼脂糖浓度为0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱 性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明 5.各种pH值的Trs缓冲液的配制 各种pH值的Tris缓冲液的配制 所需pH值(25℃) 0. I molL HCl的体积 7.2
30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚蓝 40%(W/V)蔗糖水溶液 4℃ 碱性加样缓冲液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚绿 0.25%二甲苯青 FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现 颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移 动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关。以 0.5×TBF 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的 泳动速率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同。 在琼脂糖浓度为 0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱 性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。 5．各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制 各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制 所需 pH 值（25℃） 0.1mol/L HCl 的体积 7．1 45．7 7．2 44．7 7．3 43．4 7．4 42．0 7．5 40．3
6.2 8.2 8.3 17.2 8.6 12.4 8.7 8.9 某一特定pH值的0.05 mo/ Tris缓冲液的配制:将0ml0.mol/ L Tris碱溶液与上表所示相应体积(单 位:ml)的O.m/LHCl混合,加水将体积调至10oml (2)温度对50 mmolL TrisHCl液pH值的影响 7.3 7.5
7．6 38．5 7．7 36．6 7．8 34．5 7．9 32．0 8．0 29．2 8.1 26.2 8.2 22.9 8.3 19.9 8.4 17.2 8.5 14.7 8.6 12.4 8.7 10.3 8.8 8.5 8.9 7.0 某一特定 pH 值的 0.05mol/L Tris 缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris 碱溶液与上表所示相应体积（单 位：ml）的 0.1ml/L HCl 混合，加水将体积调至 100ml （2）温度对 50mmol/L Tris·HCl 液 pH 值的影响 4℃ 25℃ 37℃ 8．1 7．5 7．2 8．2 7．6 7．3 8．3 7．7 7．4 8．4 7．8 7．5 8．5 7．9 7．6