SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定蛋白质分子量 授课教师:周杰
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量 授课教师：周杰
实验目的 学习 SDS-PAGE测定蛋自质分子量的原 理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 °运用 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染 色鉴定
一 . 实验目的 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染 色鉴定
二实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这 种现象称为电泳。 电泳分类:移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 °区带电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜, 现在则多用聚丙烯酰胺(PAGE)和琼脂糖凝胶
二 .实验原理 • 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这 种现象称为电泳。 • 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 • 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。 • 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃 珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶
实验原理 PAG根据其有无浓缩效应,分为连续系统 和不连续系统两大类,连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒 在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH, 凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛 效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳
二. 实验原理 • PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统 和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳
实验原理 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,、是在聚丙烯酰胺凝胶系统中 引进SDS 烷基磺酸钠 SDS能断裂分子内和分 关健,破坏蛋自质的二级和三级结构强还原剂能使 简的二硫键断裂,蛋白质 定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负 电荷的SDS蛋自质复合物,这种 物于结合大量的 SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为悸征的负离子团块,从而降低或消除了备种蛋百 质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋自质分子的迁移 蛋自质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式: Og K-bx,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋百质在相同条 件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量
二. 实验原理 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中 引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量