个cH 胡萝卜素主要存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜素为食物的家贪、兽类、水产动物 的体内也会含有胡萝卜素。 胡萝人素对热、酸、碱都比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝人 素可溶于脂肪及大多数有机溶剂，纯品为深红色带有金属光泽的晶体，其溶液在450m波 长处有最大吸收（正己烷），故只要能完全分离，便可定性定量。分离的方法常有纸层析 柱层析和高效液相色谱法等。国家标准GB12389一90采用的是纸层析法。 (一)原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层 析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗 脱后于450nm波长下进行比色测定。 (二)定步骤 1.样品处理 对于含脂量不高的样品，如粮食、水果、蔬菜等，样品经磨粉或打成匀浆后，直接加入 丙酮一石油醚混合溶剂反复抽提，直至抽提液无色为止，然后用分液漏斗分离出溶剂相经浓 缩定容后供层析点样用。如果是含脂量较高的样品，如植物 、油籽油料等，则需在提取色 素前先经50%KO州乙醇溶液皂化处理，皂化液再用石油醚反复提取。皂化过程可破坏植物 细胞壁，使胡萝卜素释放完全，并且可破坏叶绿素，减少对胡萝素卜素的色素分离干扰。 2.浓缩与定深 提取液经洗涤分离后，溶剂相减压蒸发，最后用石油醚定容，备层析点样用。 8. 展开与洗脱 按纸层析要求点样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全 分开后，取出滤纸，自然挥发干石油酰，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测 定。 4.比色与含量计算 国标法采用1cm比色杯，于450m波长下吸光府从标准曲线上查出一湖萝人素含 量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以B一胡萝卜素计）。 (三)讨论 1.植物性样品中，胡萝卜素常与黄酮类物质、叶绿素等有色物质共存，黄桐类物质极 性稍大。叶绿素易在强碱性溶液中被降解。采用适当的分离方法可使胡萝卜素同其他干扰物 质分离。 2.皂化处理可提高胡萝卜素由细胞壁中的释放，并且减少提取时出现的乳化现象而带 来的误差。但皂化过程中的热处理会导致异构化反应的出现，反式结构的类胡萝卜素可能均 转化为顺式结构。 3.纸层析法、柱层析法均不能区分α一、B一和y一胡萝卜素，虽然标准品为那一胡萝卜 素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为B一胡萝卜素，故对结果影响不大。 4.用HPLC法可以获得更好的结果，其样品前处理与纸层析法基本相同，该法可以区 分α一、B一胡萝卜素，是一种目前先进的测定方法 四、维生素D的测定 维生素D是指含有抗狗偻病活性的一类物质，又称钙（或骨）化醇，系类固醇的衍生 物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在，具有维生素D活性的 6
6 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H3C CH3 胡萝卜素主要存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜素为食物的家禽、兽类、水产动物 的体内也会含有胡萝卜素。 胡萝卜素对热、酸、碱都比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝卜 素可溶于脂肪及大多数有机溶剂，纯品为深红色带有金属光泽的晶体，其溶液在 450nm 波 长处有最大吸收（正己烷），故只要能完全分离，便可定性定量。分离的方法常有纸层析、 柱层析和高效液相色谱法等。国家标准 GB12389－90 采用的是纸层析法。 （一）原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层 析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗 脱后于 450nm 波长下进行比色测定。 （二）测定步骤 1．样品处理 对于含脂量不高的样品，如粮食、水果、蔬菜等，样品经磨粉或打成匀浆后，直接加入 丙酮－石油醚混合溶剂反复抽提，直至抽提液无色为止，然后用分液漏斗分离出溶剂相经浓 缩定容后供层析点样用。如果是含脂量较高的样品，如植物油、油籽油料等，则需在提取色 素前先经 50％KOH 乙醇溶液皂化处理，皂化液再用石油醚反复提取。皂化过程可破坏植物 细胞壁，使胡萝卜素释放完全，并且可破坏叶绿素，减少对胡萝素卜素的色素分离干扰。 2．浓缩与定容 提取液经洗涤分离后，溶剂相减压蒸发，最后用石油醚定容，备层析点样用。 3．展开与洗脱 按纸层析要求点样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全 分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测 定。 4．比色与含量计算 国标法采用 1cm 比色杯，于 450nm 波长下测吸光度，从标准曲线上查出－胡萝卜素含 量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以β－胡萝卜素计）。 （三）讨论 1．植物性样品中，胡萝卜素常与黄酮类物质、叶绿素等有色物质共存，黄酮类物质极 性稍大。叶绿素易在强碱性溶液中被降解。采用适当的分离方法可使胡萝卜素同其他干扰物 质分离。 2．皂化处理可提高胡萝卜素由细胞壁中的释放，并且减少提取时出现的乳化现象而带 来的误差。但皂化过程中的热处理会导致异构化反应的出现，反式结构的类胡萝卜素可能均 转化为顺式结构。 3．纸层析法、柱层析法均不能区分α－、β－和γ－胡萝卜素，虽然标准品为β－胡萝卜 素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为β－胡萝卜素，故对结果影响不大。 4．用 HPLC 法可以获得更好的结果，其样品前处理与纸层析法基本相同，该法可以区 分α－、β－胡萝卜素，是一种目前先进的测定方法。 四、维生素 D 的测定 维生素 D 是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又称钙（或骨）化醇，系类固醇的衍生 物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在，具有维生素 D 活性的
化合物钓有10种，记作维生素D2、D3、D,等，其中最重要的是维生素D2、维生素D3及其 雏生素D原。维生素D,无天然存在，维生素D,只存在于某些动物性食品中。但它们都可 由维生素D原（麦角固醇和7一脱氢胆固醇）经紫外线照射形成 麦角固醇 维生素D,(麦角钙化醇) 7一脱氢胆固 维生素D,(胆钙化醇 维生素D的测定方法有：比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等 比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。高效液相色谱法是目前分析维生素D的最好 方法，灵敏度高，分析速度快，是我国国标GB/T5413.9一1997所采用的方法。这里仅介绍 高效液相色谱法 一)原理 试样在焦性没食子酸保护下皂化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正相色谱柱分离富 集，再用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器测定，与标准试样比较定量。 (二)测定步骤 1.样品处理 样品溶液中加入2%焦性没食子酸乙醇溶液混匀后 再加入75%KO州溶液加热回流皂 化30min,冷却后转移入分液漏斗中，用石油醚反复萃取，萃取液浓缩，最后用1mL正己 烷溶解备用。 2.正相硅胶柱富集 推荐HPLC条件 色谱柱：4mm×30cn ,硅胶柱。 流动相：正己烷与 环已烷按体积比1：1混合，并按体积分数08%加入异丙醇。 流速：1mmin,柱温：20C,检测波长：265nm。 注射50uL维生素D标样(1ugmL)和200uL样品溶液，根据维生素D标样保留时间 收集样品于试管中，将试管用氨气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解，供检测用。 3。反相C,。柱拾测 推荐HPLC条件 色谱柱：4.6mm×25cmC1s或同等性能色谱柱。 流动相：甲醇，流速：1mL/min,柱温：20℃，检测波长：265nm。 注射50uL维生素D标准溶液和50uL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面 积或峰高。根据蜂面积（或峰高）的比值求算出样品中维生素D的含量。 (三)过论 1.本法摘自GB/T4139 1997，婴幼儿配方食品和乳粉通用检测方法中维生素D的测 定，适用于食品或强化食品及饲料中维生素D含量的测定。木法对维生素D2和D不加区 别，两者混合存在时，以总维生素D定量之。 7
7 化合物约有 10 种，记作维生素 D2、D3、D4 等，其中最重要的是维生素 D2、维生素 D3 及其 维生素 D 原。维生素 D2 无天然存在，维生素 D3 只存在于某些动物性食品中。但它们都可 由维生素 D 原（麦角固醇和 7－脱氢胆固醇）经紫外线照射形成： H3 C CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 HO CH2 H HO H CH3 H3C CH3 CH3 CH3 麦角固醇 维生素 D2(麦角钙化醇) H3C C H3 C H3 H O H3C H3C 7－脱氢胆固醇 维生素 D3(胆钙化醇) 维生素 D 的测定方法有：比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等。 比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。高效液相色谱法是目前分析维生素 D 的最好 方法，灵敏度高，分析速度快，是我国国标 GB/T5413.9－1997 所采用的方法。这里仅介绍 高效液相色谱法。 （一）原理 试样在焦性没食子酸保护下皂化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正相色谱柱分离富 集，再用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器测定，与标准试样比较定量。 （二）测定步骤 1．样品处理 样品溶液中加入 2％焦性没食子酸乙醇溶液混匀后，再加入 75％KOH 溶液加热回流皂 化 30min，冷却后转移入分液漏斗中，用石油醚反复萃取，萃取液浓缩，最后用 1mL 正己 烷溶解备用。 2．正相硅胶柱富集 推荐 HPLC 条件。 色谱柱：4mm×30cm，硅胶柱。 流动相：正己烷与环己烷按体积比 1：1 混合，并按体积分数 0.8％加入异丙醇。 流速：1mL/min，柱温：20℃，检测波长：265nm。 注射 50uL 维生素 D 标样（1ug/mL）和 200uL 样品溶液，根据维生素 D 标样保留时间 收集样品于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入 0.2mL 甲醇溶解，供检测用。 3．反相 C18柱检测 推荐 HPLC 条件 色谱柱：4.6mm×25cm C18 或同等性能色谱柱。 流动相：甲醇，流速：1mL/min，柱温：20℃，检测波长：265nm。 注射 50uL 维生素 D 标准溶液和 50uL 样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素 D 峰面 积或峰高。根据峰面积（或峰高）的比值求算出样品中维生素 D 的含量。 （三）讨论 1．本法摘自 GB/T5413.9－1997，婴幼儿配方食品和乳粉通用检测方法中维生素 D 的测 定，适用于食品或强化食品及饲料中维生素 D 含量的测定。本法对维生素 D2 和 D3 不加区 别，两者混合存在时，以总维生素 D 定量之。 H3C C H3 CH3 H O C H3 C H3