实验三种子中-淀粉酶和B-淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶几乎存在于所有的植物中，尤其在禾谷类种子中活性最强。植物种子中存在多 种淀粉酶，如淀粉酶、阝淀粉醇、葡萄糖淀粉酶和R-酶等，其中起主要作用的是a淀粉 酶和-淀粉酶。在种子萌发开始后，-淀粉酶活性随种子萌发天数的增加而急剧增加，是 水解淀粉的起始酶。B淀粉酶与Q淀粉酶联合作用，将淀粉水解为麦芽糖。 a-淀粉酶和-淀粉酶的理化特性不同。a-淀粉酶耐热不耐酸，在70℃加热15min仍能 保持其活性，但当pH<3.6时则饨化。B淀粉酶耐酸不耐热，70℃加热15mi则饨化，但 pH3.3时仍有活力： 本实验采用先测定+)淀粉酶总活性，然后用加热法纯化卜淀粉酶，测定-淀粉酶 活性。淀粉酶水解生成的还原糖可将黄色的3，、.二硝基水扬酸还原为橙红色的氨基化合 物。在一定范围内，还原糖的量与反应液颜色的深浅成比例关系，利用比色法可测出麦芽 糖的含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉醇活性的大小。 二、目的要求 1.掌握禾谷类作物种子~淀粉酶和B-淀粉酶活性测定的原理。 2。掌握禾禾谷类种子萌发过程中淀粉降解的主要途径。 三、仪器设备 (1)分光光度计 (2)离心机 (3)研体 (4)量简50mL (5)试管10mL×5 (6)具塞刻度试管25mL×10 (7)移液管5mL×2,1mL×2:2mL×3 (8)水浴锅 (9)离心机 (10)分析天平
(11)玻璃棒、石英砂 四、试剂 (1)1%淀粉液：1g淀粉溶于100mL蒸馏水。 (2)0.4 mol/LNaOH溶液：16 g NaOH溶于1000mLH20中。 (3)pH5.6柠檬酸缓冲液：取11mLA液和29mLB液混匀即可。 A液：Q.1mo/L柠檬酸(21.01gC6H807.H20溶于1000mLH20): B液：Q,1mol/L柠檬酸钠(29,41gC6H507Na3.2H20溶于1000mLH20)。 (4)35-二硝基水扬酸：称取3,5-二硝基水扬酸1g,溶于20mL1mo/LNa0H (40gL)中，加蒸馏水50mL,再加入酒石酸钾钠30g,溶解后，用蒸馏水稀释到100mL, 盖严勿使C02进入，贮于暗处。 (5)麦芽糖标准液：100mg分析纯麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，定容至100mL。 五、材料 芽长1cm左右的小麦种子、玉米种子。 六、方法和步骤 1制作标准曲线 取25mL具塞刻度试管5支，按下表加入各种试剂： 试管编号 2 3 1mg/mL麦芽糖标准液(mL)0 05 1.0 15 20 蒸馏水(mL) 201.51.0 0.5 0 3,5.二硝基水扬酸(m) 20 20 20 20 2.0 岁芽糖含量(mg/mL)00.51.01.52.0 混匀，在沸水浴中加热5mi,取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL刻度，混匀。在 520m下比色c记录光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2薛提取液的制备 称取萌发小麦种子5多置研钵内，加少许石英砂及少量蒸馏水，研成匀浆后， 50mL量筒内，用蒸馏水稀释至刻度，在室温(20℃)放置，并每隔数分钟用玻棒援 9
20min后，将澄清液离心，取离心后的上清液备用。 3-淀粉膏活性的测定 (仙)取试管4支，两支为对照，两支为测定管。 (2)给各试管加入酶提取液1mL,在70℃水浴中准确加热l5min(在此期间，阝淀粉 酶被钝化)。取出试管用自来水冷却。 (3)给各试管加入pH5.6的缓冲液1mL。 (4)给对照管加入0.4 mol/L NaOH溶液4mL(以钝化酶的活性)。再加入1%淀粉溶 液2mL,混匀。 (⑤)将测定管置40℃恒温水浴中保温15min,再加入40℃预热的1%淀粉液2mL。摇 匀后立即放入40℃水浴中准确保温5min。取出后，迅速加入0.4 mol/LNaOH溶液4mL 然后准备下一步糖的测定： (⑥)糖含量的测定 取以上各管中酶作用后的溶液以及对照管中的溶液各2mL,分别加入到25mL具塞 刻度试管中，再加入2mL3,5.二硝基水扬酸试剂混匀，置沸水浴中准确加热5mim,取 出冷却，用蒸馏水稀释至25mL刻度，混匀。在520mm下比色。记录光密度，又标准曲 线求出麦芽糖含量，并铵下式计算酶活性。 4(α+)淀粉酶总活性的测定 取上述酶提取液5mL,放入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀定容。混匀后，取4支试 管，两支为对照，两支为测定管。给各管加入稀释过的酶液1mL以及pH5.6的缓冲液 1mL。以下步骤与a-淀粉酶活性的测定中的(4)、（⑤）、(6)湘同。 七、结果计算 a-淀粉酶的活性（麦芽糖mggFW.5min)= (A-A')xV 样品重(g)xC (B-B)×V (a+)淀粉酶的活性（麦芽糟ng.gFW,5min')= 样品重(g)×C 式中：A一-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的毫克数： A一—Q淀粉酶对照管中麦芽糖含量：
B一(Q+)淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的毫克数： B一（α+f)淀粉酶对照管中麦芽糖含量： C—比色时所用样液毫升数： V—样品稀释总体积
实验四种子中可溶性蛋白质含量的测定 一一考马斯亮蓝法 一、原理 考马斯亮蓝G250(Coomassie Bril训liant Blue G-250)是一种染料，在游离状态下呈棕红 色。1976年，M.M.Bradford发现考马斯亮蓝G-250与蛋白质后变为蓝色（青色），它的 光吸收峰从从465nm改变到595nm。蛋白质含量在0~1000g范围内，蛋白质-色素结合 物在595m下的吸光度质与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。种子蛋白质的考马 斯亮蓝G-250法，具有简便快捷（反应约在2mn左右达到平衡），灵敏度高，稳定性好（在 室温1h内稳定)的特点，是一种较常用方法。 二、目的要求 1掌握考马斯亮蓝法测定种子中可溶性蛋白质含量的原理和方法。 2比较不同小麦品种的种子蛋白质含量。 三、仪器设备 (1)分析天平 (2)离心机 (3)721型分光光度计 (4)离心管2mL×6 (5)具塞试管10mL×8 (6)吸管 0.1mLX1,1ml×2,5mL×1 (7)研体 (8)漏斗 (9)容量瓶10mL或20mL、25mL 四、试剂 (1)标准蛋白质溶液(100gmL):准确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水 定溶至100mL。 12