思考题 1.写出蛋白质中可以与双缩酥试剂反应的化学基团的名称及化学结构。 能进行反冷公，于中多须有几儿个上运化学基团才能给出风笔跟反应的性结果：风榨系试与二肤和三肤怎 ?子如果蛋白质水解作用一直进行到双缩歌反应呈阴性结果，此时可对水解作用进行的程度微出 化蛋自质中的氢落酸的平约分子为135，在分子量为5的蛋白质分子中在者多少个上 5.茚三丽反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。 6.你能区分蛋白质带三酮反应及其他氨基化合物茚三阴反应的结果吗？试解释之 7。能否利用茚三刚反应可靠地鉴定蛋白质的存在 8,哪些芳香基团（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用早现黄色反应的阳性结果？ 9.是否所有氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果？为什么？是否大部分蛋白质呈现阳性结果？为什么
思 考 题 1．写出蛋白质中可以与双缩脲试剂反应的化学基团的名称及化学结构。 2．一个分子中必须有几个上述化学基团才能给出双缩脲反应的阳性结果？双缩脲试剂与二肽和三肽都 能进行反应吗？ 3．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解作用进行的程度做出什么结 论？ 4．如果蛋白质中的氨基酸的平均分子量为 125，在分子量为 150000 的蛋白质分子中存在着多少个上 述化学基团？ 5．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。 6．你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。 7．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？ 8．哪些芳香基团（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？ 9．是否所有氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果？为什么？是否大部分蛋白质呈现阳性结果？为什么？
3.3蛋白质的性质（二）一蛋白质等电点的测定和沉淀反应 Ⅱ，蛋白质的沉淀反应 一、目的： 稳定因素的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意 二、原理： 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在 一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 ()可逆的沉淀的反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化 因素 蛋白 溶解于原来的 白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利月 此类反应。 (2)不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀 天度舞属类爱剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝调，蛋白质与重金属离子或菜些有机酸的一 三、器材及试剂： ①蛋白质溶液5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新洋鸡蛋清：水=1：9） ②pH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲溶液 ③3%硝酸银溶液 ④5%三氯乙酸溶液 ⑤95%乙醇 ⑥饱和硫酸铵溶液 (⑦硫酸铵结品粉末 ⑧0.1molL盐酸溶液 ⑨0.1mol/L氢氧化钠溶液 ⑩0.05molL碳酸钠溶液 ①0.1molL醋酸溶液 ①甲基红溶液 重2%氨化钡溶液 四、操作步骤： 1,蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐 的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是 可逆过程。 加5%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟 则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容 物过滤，向滤液中添加疏酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋自。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2.重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物 取1支试管，加入蛋白质溶液2L,再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产 生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？ 3.某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL,再加1mL5%三氯乙
3.3 蛋白质的性质（二）—蛋白质等电点的测定和沉淀反应 Ⅱ．蛋白质的沉淀反应 一、目的： 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意 义，了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、原理： 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在 一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的 因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋 白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用 此类反应。 （2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀， 不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的 反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变 性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、器材及试剂： ①蛋白质溶液 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清∶水=1∶9） ②pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液 ③3%硝酸银溶液 ④5%三氯乙酸溶液 ⑤95%乙醇 ⑥饱和硫酸铵溶液 ⑦硫酸铵结晶粉末 ⑧0.1 mol/L 盐酸溶液 ⑨0.1 mol/L 氢氧化钠溶液 ⑩0.05 mol/L 碳酸钠溶液 ○11 0.1 mol/L 醋酸溶液 ○12 甲基红溶液 ○13 2%氯化钡溶液 四、操作步骤： 1．蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐 的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是 可逆过程。 加 5%卵清蛋白溶液 5 mL 于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟 则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容 物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2．重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 取 1 支试管，加入蛋白质溶液 2 mL，再加 3%硝酸银溶液 1~2 滴，振荡试管，有沉淀产 生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？ 3．某些有机酸沉淀蛋白质 取 1 支试管，加入蛋白质溶液 2 mL，再加 1 mL5%三氯乙
酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察 沉淀是否溶解。 是产白质取1支试加入2L白质流再入2乙 5.乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 、试剂(ml) 95%乙醇 冲溶液 管号 溶液 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8L,然后在第2、3号管 中各加一滴甲基红，再分别用0.1moL醋酸溶液及0.05molL碳酸钠溶液中和之。观察各 管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mo/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释 各管发生的全部现象。 思考题 1,你如何从低分子量的胺类化合物（非蛋白质的化合物）分离出蛋白质来？ 2、鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂 3.氯化汞为何能做为杀茵剂？ 4.沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往件随变性 5.有机酸（如三氯乙酸）沉淀蛋白质有无实际应用意义？ 6。有机溶剂是否一定引起蛋白质发生变性： Ⅲ.蛋白质等电点测定 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 二、原理： 蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符 号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。 中皮票分看的种商的位有大关系。蛋白质是青电解质在性溶液 这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂 如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加 明显。 COOH NH. 蛋白质分了 c00 C00 COOH NH2 NH NH 明离子 掖性离子 阳离子 pH>pl pH=pl pH<pI 各 电场中：移向阴极 不移动 移向阴极 种蛋白质的
酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察 沉淀是否溶解。 4．有机溶剂沉淀蛋白质 取 1 支试管，加入 2 mL 蛋白质溶液，再加入 2 mL95%乙醇。 混匀，观察沉淀的生成。 5．乙醇引起的变性与沉淀 取 3 支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 试剂（ml） 管号 5%卵清 蛋白溶液 0.1 mol/L 氢氧化钠 溶 液 0.1 mol/L 盐酸溶液 95%乙醇 pH4.7 缓冲溶液 1 2 3 1 1 1 — 1 — — — 1 1 1 1 1 — — 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水 8 mL，然后在第 2、3 号管 中各加一滴甲基红，再分别用 0.1 mol/L 醋酸溶液及 0.05 mol/L 碳酸钠溶液中和之。观察各 管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加 0.1 mol/L 盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释 各管发生的全部现象。 思 考 题 1．你如何从低分子量的胺类化合物（非蛋白质的化合物）分离出蛋白质来？ 2、鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 3．氯化汞为何能做为杀菌剂？ 4．沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往伴随变性？ 5．有机酸（如三氯乙酸）沉淀蛋白质有无实际应用意义？ 6．有机溶剂是否一定引起蛋白质发生变性？ Ⅲ．蛋白质等电点测定 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 二、原理： 蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符 号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的 pH 值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液 中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子： 蛋白质分子所带净电荷为零时的 pH 值称为蛋白质的等电点（PI）。在等电点时，蛋白 质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以 这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂 如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加 明显。 各 种蛋白质的
等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电 军8品者是554鱼精 焦技术加型的 生蛋白：其等电点在 20124 用 度最大时目 蛋白 三、器材及试剂： 1.器材： 2 mL (2) ①0.01molL醋酸溶液。 ②0.1molL醋酸溶液。 ③1mol/L醋酸溶液， ④1mL氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。 ⑤酪蛋白。 (1)称取酪蛋白3g,放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水 1毫升 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解 好的蛋白溶液转移到500L容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。 (3)在容量瓶中再加入1mol/醋酸溶液50mL,摇匀。 (4)加入蒸馏水定容至500mL,得到略现浑浊的，在0.1 molLNaAc溶液中的酪蛋白 胶体。 2.等电点测定 按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并淮确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加 入后立即摇匀 蛋白质 0.01mol/L (mL (mL) (mL) 8.38 0.62 5.9 7.75 1.25 5.6 3 875 025 53 41850 050 50 8.00 1.00 4.7 6 7.00 2.00 4.4 7 5.00 4.00 4.1 8 1.00 8.00 38 917.40 1.60 3.5 观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，+，+， 表示浑浊度。 思考顺 这种结论时等电点有何实际应用意义
等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是 4.7~4.8，血红蛋白等电 点为 6.7~6.8，胰岛素是 5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在 pH12.0~12.4。 近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验 采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的 pH 值即为该种蛋白 质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。 三、器材及试剂： 1．器材： ①试管 1.5×cm（×9）。 ②吸管 1mL（×2），2 mL（×2），10mL（×2）。 ③容量瓶 50mL（×2），500mL（×1）。 ④试管架。 2．试剂： ①0.01mol/L 醋酸溶液。 ②0.1mol/L 醋酸溶液。 ③1 mol/L 醋酸溶液。 ④1 mol/L 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。 ⑤酪蛋白。 四、操作步骤： 1．制备蛋白质胶液 （1）称取酪蛋白 3g，放在烧杯中，加入 40℃的蒸馏水。 （2）加入 50 毫升 1 mol/L 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解 好的蛋白溶液转移到 500mL 容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。 （3）在容量瓶中再加入 1 mol/ 1 醋酸溶液 50mL，摇匀。 （4）加入蒸馏水定容至 500mL，得到略现浑浊的，在 0.1 mol/LNaAc 溶液中的酪蛋白 胶体。 2．等电点测定 按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加 入后立即摇匀。 管 号 蛋白质 胶液 (mL) H2O (mL) 0.01mol/L HAc (mL) 0.1mol/L HAc （mL） 1mol/L HAc （mL） pH 观 察 0 分钟 10 分 钟 20 分 钟 1 1 8.38 0.62 — — 5.9 2 1 7.75 1.25 — — 5.6 3 1 8.75 — 0.25 — 5.3 4 1 8.50 — 0.50 — 5.0 5 1 8.00 — 1.00 — 4.7 6 1 7.00 — 2.00 — 4.4 7 1 5.00 — 4.00 — 4.1 8 1 1.00 — 8.00 — 3.8 9 1 7.40 — — 1.60 3.5 观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++， 表示浑浊度。 思 考 题 1．在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。 2．本实验中，酪蛋白质在等电点时从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。 这种结论对吗？为什么？ 3．在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？
3.4血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、目的： 带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳现象早在19世纪初期就被人们发现了， 并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在20世纪40年代左右。近年来各种类型的 电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉 凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶 液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和 自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳 技术的应用范围。 各种类型的电泳技术概括如表 电泳技术的种类 别 名 形 Tiselleus式微量电泳 显微电泳 不用支持物的电泳技术 等电聚焦电泳 属自由电泳 密度梯度电泳 纸上电 包括常压 高压电泳 酸纤维薄膜电泳 (水平式或垂直式) 平板法 用支持物的电泳技术 (1)淀粉凝胶 (2)聚丙烯酰胺凝 1)回度由注 垂直式（柱状法】 2)平板电泳 垂省式或水平式 3)SDS-圆盘电泳 垂直式（测相对分子质量） (3)琼脂糖凝胶电泳 平板法或柱状法（如免疫电泳 (4)琼脂凝胶电泳 】双向电球 用法 2.电泳层析相结合技术 3.交义电泳法 4。连续纸电泳 任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸 附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等 物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性 溶液中（即溶液的p州值大于等电点p),分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性 溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的名少和分子的大小。 不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定
3.4 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、目的： 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。 二、原理： 带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳现象早在 19 世纪初期就被人们发现了， 并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在 20 世纪 40 年代左右。近年来各种类型的 电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉 凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶 液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和 自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳 技术的应用范围。 各种类型的电泳技术概括如表 电泳技术的种类 类 别 名 称 形 式 不用支持物的电泳技术 1．Tiselleus 式微量电泳 2．显微电泳 3．等电聚焦电泳 4．等速电泳 5．密度梯度电泳 属自由电泳 用支持物的电泳技术 1．纸上电泳 2．醋酸纤维薄膜电泳 3．薄层电泳 4．非凝胶支持物区带电泳 支持物有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉、 硅胶、合成树脂粉末 5．凝胶支持物区带电泳 （1）淀粉凝胶 （2）聚丙烯酰胺凝胶 1）圆盘电泳 2）平板电泳 3）SDS-圆盘电泳 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）琼脂凝胶电泳 包括常压、高压电泳 （水平式或垂直式） 水平式事垂直式 （平板法、柱状法） 垂直式（柱状法） 垂直式或水平式 垂直式（测相对分子质量） 平板法或柱状法（如免疫电泳） 用 法 1．双向电泳 2．电泳-层析相结合技术 3．交叉电泳法 4．连续纸电泳 任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸 附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等 物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性 溶液中（即溶液的 pH 值大于等电点 pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性 溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。 不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定