每一物质的R值决定于该物质在两相间 的分配系面定相)和有机泽剂流动相商 所以 刑前礼 的主要快定因素是分配系《 物质在一条件下的ā值是周定的。因此R 值为其特征常数。 现将影响R,值的因素概括如下： 原点 极性溶 溶于非极性溶剂（有机溶剂） 碱性氨 所以物质的极性大小 所前者在水固定相中分配较多，因此R低于后 酸极性大于中性氨基酸 一CH一基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则一CH一基增加，整个分子 的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，R值亦随之增加，例如氨基酸的R/值： 甘氨酸<丙氨酸<亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸<谷氨酸。 极性基团的位置不同也会引起R变化，例如在正丁醇甲酸-水系统中层析时，α丙氨 酸的R值大于B-丙氨酸。 洗择溶剂系统时应使被分离物质 溶剂的极性大小也影响物质的值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的 值随着溶剂碳原子数目增加而降低。 碳性含胖空游剂系货的阳会影响物质侵性装团的解离形式的氨装酸在酸性或 R-NH NHa R OH CCOOH 对于酸性氨基酸，在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷越少亲水性越小，因此在酸 性溶剂中值较碱性中大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双 向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。 溶剂的州还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极 性物质如（氨基酸）来说R值增加，非极性物质则减心 若不适合，使同种物质有不 必 4、纸的影响，层析纸以须质地均匀、紧密。右一定机械强度，并日杂质拉少。加 纸中含有Ca+、Mg ,可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影， 可用稀酸(0.01moi/L或0.4 mol/LHC1)洗涤滤纸除去之。 5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤 维素的水合作用。温度变化对R值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相 差不超过±0.5℃。 除上述因素影响R值外。样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有 效分离 无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚 三酮作显色剂。 茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严
每一物质的 Rf 值决定于该物质在两相间 的分配系数（α）和两相的体积比。这两种相 即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。两 相体积比在同一实验情况下是不变的，所以 R f 值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某 一物质在一条件下的α值是固定的。因此 R f 值为其特征常数。 现将影响 R f 值的因素概括如下： 1、物质结构的影响：极性物质是易溶于 极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小 决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸， 所以前者在水（固定相）中分配较多，因此 R f 低于后者。 —CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子 的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf 值亦随之增加，例如氨基酸的 R f 值： 甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。 极性基团的位置不同也会引起 R f 变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨 酸的 R f 值大于β-丙氨酸。 2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中 R f 值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在 适当 Rf 值范围内（0.005 到 0.85 之间），并且不同物质的 R f 至少差别为 0.05 才能彼此分开。 溶剂的极性大小也影响物质的 Rf 值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的 Rf 值随着溶剂碳原子数目增加而降低。 3、pH 的影响：溶剂系统的 pH 会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或 碱性溶剂中变化如下： 对于酸性氨基酸，在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷越少亲水性越小，因此在酸 性溶剂中 Rf 值较碱性中大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双 向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。 溶剂的 pH 还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极 性物质如（氨基酸）来说 Rf 值增加，非极性物质则减少。若 pH 不适合，使同种物质有不同 解离形式，其 Rf 也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须 足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状 图谱。 4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如 纸中含有 Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影， 可用稀酸（0.01mol/L 或 0.4mol/LHCl）洗涤滤纸除去之。 5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤 维素的水合作用。温度变化对 Rf 值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相 差不超过±0.5℃。 除上述因素影响 Rf 值外。样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有 效分离。 无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚 三酮作显色剂。 茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严 R NH2 COO - OH - H + R NH3 + COO - H + OH - R NH3 + COOH R NH2 COO - OH - H + R NH3 + COO - H + OH - R NH3 + COOH
格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会 出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。 ,借比色法可定量测定氨基酸含量」 三、器材及试剂： 1.器材： ①层析缸②毛细管③喷雾器④培养皿⑤层析滤纸（新华一号）。 2.试剂： ①展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20幸升正丁醇和5亲升冰融 酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内 的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 ③显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液 四、操作步廉： 1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 笔在点样点下端出所氨酸的名称】 3。点样：用毛细管将各氨基酸样品分 别点在这五个位置上。电吹风吹干后再点 次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大 不超过3毫米。 于密 直于培养中 析 ,并将滤 的液面需低于点样线1厘米。特溶剂上升 一芝首者首若 厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干檬或用吹风机热风吹干。 5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮丙酮溶液：然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃) 或用热风吹干即可显出各层析斑点。 五、结果与讨论： 1.计算出各种氨基酸的R值，并根据R值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱 上标出各氨基酸名称。 2.对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析
格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会 出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。 铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱 层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。 三、器材及试剂： 1．器材： ①层析缸 ②毛细管 ③喷雾器 ④培养皿 ⑤层析滤纸（新华一号）。 2．试剂： ①扩展剂：4 份水饱和的正丁醇和 1 份醋酸的混合物。将 20 毫升正丁醇和 5 毫升冰醋 酸放入分液漏斗中，与 15 毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内 的扩展剂约 5 毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 ②氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组 份浓度均为 0.5%）。 ③显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 四、操作步骤： 1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2．取层析滤纸（长 18—20 厘米，宽 14 厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘 2 —3 厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔 2 厘米作一记号，作为点样位置，并用铅 笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品分 别点在这五个位置上。电吹风吹干后再点一 次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大 不超过 3 毫米。 4．扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的 两边不能接触。将盛有约 20 毫升扩展剂的 培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸 直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂 的液面需低于点样线 1 厘米。待溶剂上升 15 厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5．显色：用喷雾器均匀喷上 0. 1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤 5 分钟（100℃） 或用热风吹干即可显出各层析斑点。 五、结果与讨论： 1．计算出各种氨基酸的 Rf 值，并根据 Rf 值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱 上标出各氨基酸名称。 2．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析
3.2蛋白质的性质（一）一蛋白质及氨基酸的成色反应 】.蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、目的： 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式，了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应 原理，学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、呈色反应： (一)双缩脲反应 1.原理： 素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与C2+结合 生成紫红色化合物。 此反应称为双缩反厅 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似 也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应式如下： NHz C-0 NH2 c-0 NHz NH:180 c NH+NH↑ c- 0 NH2 双缩歌 NH O H H O C-0 C-N HN Cu N-C CNH NH 紫红色化合物 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个一CS一NH2 CH一NH,一CRH-NH,一CH-NH一CHNH-CHOH或-CHOHCH.NH等基团 的物质以及乙二酰二胺(O=C一七=O)等物质也有此反应。NH也干扰此反应，因 为NH与C2可生成暗蓝色的络离子Cu(NH)4*。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽 都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽， 2.试剂： ①尿素 ②10%氢氧化钠溶液 ③1%硫酸铜溶液 ④2%卵清蛋白溶液 3.操作： 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时， 停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化纳溶液约1ml,振荡混匀，再加 1 ,再振荡。观察出现的粉红颜色。要避兔添加过量硫酸铜，否则，生成 的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色
3.2 蛋白质的性质（一）—蛋白质及氨基酸的成色反应 Ⅰ．蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、目的： 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式，了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应 原理，学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应： （一）双缩脲反应 1．原理： 素加热至 180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与 Cu2+结合 生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似， 也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应式如下： 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—CS—NH2，— CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH 或—CHOHCH2NH2 等基团 NH2 NH2 的物质以及乙二酰二胺 （O＝C——C＝O）等物质也有此反应。NH3 也干扰此反应，因 为 NH3 与 Cu 2+可生成暗蓝色的络离子 Cu（NH3）4 2+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽 都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 2．试剂： ①尿素 ②10%氢氧化钠溶液 ③1%硫酸铜溶液 ④2%卵清蛋白溶液 3．操作： 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时， 停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10%氢氧化钠溶液约 1ml，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成 的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色
向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氧氧化钠溶液约2ml,摇匀，再加1%硫酸 铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 (二)苗三翻反应 1,原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α一氨基酸及一切蛋白质都 能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 腰 ,马尿酸、 然蛋 和氨 三酮反应，但能 该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨 基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH和醛，水合茚三酮被还 原成还原型茚三酮：第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合苗三酮分子和氨缩合生成 有色物质。 反应机理如下 NHs CO:+R- H:N-C-COOH OH 此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不 同，酸度过大时甚至不显色。 2.试剂： ①蛋白质溶液 2%卵清蛋日 新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9） 甘氨 01%事三解 乙醇溶液 3.操作： ①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml,再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液， 混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 (三)黄色反应
向另一试管加卵清蛋白溶液约 1ml 和 10%氢氧化钠溶液约 2ml，摇匀，再加 1%硫酸 铜溶液 2 滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 （二）茚三酮反应 1．原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都 能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚 氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应 的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1∶1 500 000 浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨 基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH3 和醛，水合茚三酮被还 原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成 有色物质。 反应机理如下： 此反应的适宜 pH 为 5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同 pH 条件下的颜色深浅不 同，酸度过大时甚至不显色。 2．试剂： ①蛋白质溶液 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9） ②0.5%甘氨酸溶液 ③0.1%茚三酮水溶液 ④0.1%茚三酮-乙醇溶液 3．操作： ①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液， 混匀，在沸水浴中加热 1~2 分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 ②在一小块滤纸上滴一滴 0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1%茚三酮乙 醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 （三）黄色反应
1,原理： 岁花结枸的氯基酸。如酪氨酸和色氨酸，渴硝酸后，可校随化成黄色物质， 黄色的硝醒酸钠。反应式如下 防基设色) N-O Na" 邻骑限酸的（橙黄色） 多数蛋白质分子含有带苯环的氢基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少 量浓硫酸才有黄色反应。 2.试剂： ①鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用6层纱布过滤。 ②大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。 ③头发 ④指甲 ⑤0.5%苯酚溶液 ©浓硝酸 o0%数氧液 ⑦0.3%f ⑧0.3%酪氨酸溶液 3.操作： 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或 用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色 变化。 管号 材料 溶液4滴取液4滴 少许 酚4滴氨酸4滴氨酸4滴 浓硝酸/（滴） 2 (四)考马斯亮蓝反应 1.原理： G250 工色和 种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色： 它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室 温一小时内稳定。在0.01~10mg蛋白质范围内， 蛋白质浓府A m值成正比。所以常用来 测定蛋白质含量。 2.试剂： ①蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20） ②考马斯亮蓝染液 L85%磷酸混匀，配成原液。临 3.操作： 取2支试管，按下表操作 试剂 管号 (mL L液 01
1．原理： 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合 物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。反应式如下： 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少 量浓硫酸才有黄色反应。 2．试剂： ①鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1∶20 混匀，然后用 6 层纱布过滤。 ②大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。 ③头发 ④指甲 ⑤0.5%苯酚溶液 ⑥浓硝酸 ⑦0.3%色氨酸溶液 ⑧0.3%酪氨酸溶液 ⑨10%氢氧化钠溶液 3．操作： 向 7 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或 用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色 变化。 管 号 1 2 3 4 5 6 7 材 料 鸡蛋清 溶液 4滴 大豆提 取液 4 滴 指甲 少许 头发 少许 0.5%苯 酚 4 滴 0.3%色 氨酸 4滴 0.3%酪 氨酸 4滴 浓硝酸/（滴） 2 4 40 40 4 4 4 现象 （四）考马斯亮蓝反应 1．原理： 考马斯亮蓝 G250 具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色； 当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。 它染色灵敏度高，比氨基黑高 3 倍。反应速度快，约在 2 分钟左右时间达到平衡，在室 温一小时内稳定。在 0.01~1.0mg 蛋白质范围内，蛋白质浓度 A595nm值成正比。所以常用来 测定蛋白质含量。 2．试剂： ①蛋白质溶液（鸡蛋清∶水=1∶20） ②考马斯亮蓝染液 考马斯亮蓝 G250100mg 溶于 50 mL95%乙醇中，加 100 mL85%磷酸混匀，配成原液。临 用前取原液 15 mL，加蒸馏水至 100 mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为 0.01%。 3．操作： 取 2 支试管，按下表操作 试剂 管号 蛋白质溶液 （mL） 蒸馏水 （mL） 考马斯亮蓝染液 （mL） 1 0 1 5 2 0.1 0.9 5