(三)蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法,了解各级分酶的纯化情况 、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法,必须测定各级分酶活性和比活 测定蔗糖酶活性的方法有许多种,如费林试剂法、 Nelson's试剂法、水杨酸试剂法 等,本实验先使用费林试剂法,以后测米氏常数Km和最大反应速度Vm时再用 Nelson’s 试剂法。 费林试剂法灵敏度较高,但数据波动较大,因为反应后溶液的颜色随时间会有变化, 因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下,蔗糖酶催化蔗糖水解, 生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧 化,二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀,氧化亚铜与磷钼酸作用,生成兰色溶液,其 兰色深度与还原糖的量成正比,于650nm测定光吸收值。 三、试剂 1.碱性铜试剂(用毕回收) 称10g无水NaCO3,加入100ml去离子水溶解,另称1.88g酒石酸,用100m去离 子水溶解,混合二溶液,再加入1.13克结晶 CuSo,溶解后定容到250ml 2.磷钼酸试剂(用毕回收) 在烧杯内加入钼酸175g,钨酸钠25g,10%NaOH100ml,去离子水10ml,混合 后煮沸约30min(小心不要蒸干),驱去钼酸中存在的氨,直到无氨味为止,冷却后加 85%磷酸63ml,混合并稀释到250ml。 3.025%苯甲酸200m,配葡萄糖用,防止时间长溶液长菌,也可以用去离子水代替 4.葡萄糖标准溶液: (1)贮液:精确称取无水葡萄糖(应在105℃恒重过)0.1802克,以0.25%苯甲酸溶 液溶解后,定容到100ml容量瓶中(浓度10 mmol/L)。 (2)操作溶液:用移液管取贮液10m,置于50m容量瓶中,以用0.25%苯甲酸或去 离子水稀释至刻度(浓度为2mmo/L)。 5.0molL蔗糖溶液5om,分装于小试管中冰冻保存,因蔗糖极易水解,用时取出一 管化冻后摇匀 6.0.2moL乙酸缓冲液,pH49,200ml 7.牛血清清蛋白标准蛋白质溶液(浓度范围:200~50oμg/ml,精确配制50ml)。 8.考马斯亮兰G-250染料试剂,100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml95%乙醇后, 加入120ml85%磷酸,用去离子水稀释到1L(公用) 四、仪器 1.试管20支,试管架1个 2.秒表1块,或用手表。 3.移液管:0.1、0.2、2.0、50ml
227 （三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 一、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。 二、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s 试剂法、水杨酸试剂法 等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax 时再用 Nelson’s 试剂法。 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化， 因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解， 生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧 化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其 兰色深度与还原糖的量成正比，于 650nm 测定光吸收值。 三、试剂 1. 碱性铜试剂（用毕回收） 称 10g 无水 NaCO3 ,加入 100ml 去离子水溶解，另称 1.88g 酒石酸，用 100ml 去离 子水溶解，混合二溶液，再加入 1.13 克结晶 CuSO4，溶解后定容到 250ml。 2. 磷钼酸试剂（用毕回收） 在烧杯内加入钼酸 17.5g，钨酸钠 2.5g，10% NaOH 100ml, 去离子水 100ml，混合 后煮沸约 30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加 85%磷酸 63ml,混合并稀释到 250ml。 3. 0.25%苯甲酸 200ml，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液： （1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在 105℃恒重过）0.1802 克，以 0.25%苯甲酸溶 液溶解后，定容到 100ml 容量瓶中（浓度 10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取贮液 10ml，置于 50ml 容量瓶中，以用 0.25%苯甲酸或去 离子水稀释至刻度（浓度为 2mmol/L）。 5. 0.2mol/L 蔗糖溶液 50ml，分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一 管化冻后摇匀。 6. 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。 7. 牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200～500g/ml，精确配制 50ml）。 8. 考马斯亮兰 G-250 染料试剂，100mg 考马斯亮兰 G-250 全溶于 50ml 95%乙醇后， 加入 120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到 1L（公用）。 四、仪器 1. 试管 20 支，试管架 1 个 2. 秒表 1 块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml
4.塑料可见比色杯(杯上和器皿染色后可用少量95%的乙醇荡洗) 5.水浴锅 6.电炉 7.保鲜膜 8.橡皮筋 五、各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法( Bradford法)的微量法测定蛋白质含量,参见实验-“蛋 白质含量的测定法”(因Tris会干扰 Lowry法的测定)。标准蛋白的取样量为0.1、02 03、04、0.5、0.6、0.8、1.0ml,用去离子水补足到1.0ml 各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数,并详细记录稀释倍数的计算(使用移液 管和量筒稀释)。下列稀释倍数仅供参考: 粗级分I:10~50倍 热级分Ⅱ:10~50倍 醇级分Ⅲ10~50倍 柱级分IV:不稀释 确定了稀释倍数后,每个级分取3个不同体积的样进行测定,然后取平均值,计算 出各级分蛋白质浓度 六、级分I、II、III蔗糖酶活性测定 用002 mol/L pH49乙酸缓冲液(也可以用pH~6的去离子水代替)稀释各级分酶 液,试测出测酶活合适的稀释倍数 1000~10000倍 Il:1000~10000倍 1000~10000倍 以上稀释倍数仅供参考。 按“表1”的顺序在试管中加入各试剂,进行测定,为简化操作可取消保鲜膜封口 沸水浴加热改为用90~95℃水浴加热8~10min 七、柱级分ⅣV酶活力的测定 1.酶活力的测定参照“表1”设计一个表格,反应混合物仍为lmls 2.第1管仍为蔗糖对照,9、10管为葡萄糖的空白与标准,与“表1”中的1l、12 管相同。 3.2~7管加入柱级分IV(取样前先试测出合适的稀释倍数),分别为002ml、005ml 0.1ml、0.2ml、0.4ml和0.6ml,然后各加0.2m乙酸缓冲液(02 mol/L pH49),每管用 去离子水补充到08ml 4!.1-7管各加入02ml02mol/L的蔗糖,每管由加入蔗糖开始计时,室温下准确反应 l0min,立即加入lml碱性铜试剂中止反应,然后按“表1”中的步骤进行测定 5.第8管为θ时间对照,与第7管相同,只是在加入02m蔗糖之前,先加入碱性铜 试剂,防止酶解作用。此管只用于观察,不进行计算 6.计算柱级分IV的酶活力: Units/ml原始溶液。 7.以每分钟生成的还原糖的μmoes数为纵座标,以试管中1m反应混合物中的酶浓
228 4. 塑料可见比色杯（杯上和器皿染色后可用少量 95% 的乙醇荡洗） 5. 水浴锅 6. 电炉 7. 保鲜膜 8. 橡皮筋 五、各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法（Bradford 法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验－“蛋 白质含量的测定法”（因 Tris 会干扰 Lowry 法的测定）。标准蛋白的取样量为 0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到 1.0ml。 各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液 管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 10～50 倍 热级分 II： 10～50 倍 醇级分 III： 10～50 倍 柱级分 IV： 不稀释 确定了稀释倍数后，每个级分取 3 个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算 出各级分蛋白质浓度。 六、级分 I、II、III 蔗糖酶活性测定 用 0.02mol/L pH4.9 乙酸缓冲液（也可以用 pH5～6 的去离子水代替）稀释各级分酶 液，试测出测酶活合适的稀释倍数： I ： 1000～10000 倍 II ： 1000～10000 倍 III ： 1000～10000 倍 以上稀释倍数仅供参考。 按“表 1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口， 沸水浴加热改为用 90～95℃水浴加热 8～10min。 七、柱级分 IV 酶活力的测定 1. 酶活力的测定参照“表 1”设计一个表格，反应混合物仍为 1ml。 2. 第 1 管仍为蔗糖对照，9、10 管为葡萄糖的空白与标准，与“表 1”中的 11、12 管相同。 3. 2～7 管加入柱级分 IV（取样前先试测出合适的稀释倍数），分别为 0.02 ml、0.05 ml、 0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml 和 0.6ml，然后各加 0.2ml 乙酸缓冲液（0.2mol/L pH4.9），每管用 去离子水补充到 0.8ml。 4. 1~7 管各加入 0.2 ml 0.2mol/L 的蔗糖，每管由加入蔗糖开始计时，室温下准确反应 10min，立即加入 1ml 碱性铜试剂中止反应，然后按“表 1”中的步骤进行测定。 5. 第 8 管为 0 时间对照，与第 7 管相同，只是在加入 0.2ml 蔗糖之前，先加入碱性铜 试剂，防止酶解作用。此管只用于观察，不进行计算。 6. 计算柱级分 IV 的酶活力： Units / ml 原始溶液。 7. 以每分钟生成的还原糖的moles 数为纵座标，以试管中 1ml 反应混合物中的酶浓
度(mg蛋白/m)为横座标,画出反应速度与酶浓度的关系曲线 表1级分I、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称 对照粗级分1 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ葡萄糖 管数→ 101 酶液(m) 000050200500050200500050200.507 060550400.10050200100550400.101008 乙酸缓冲液 0.20.20.20.2020.20.20.20.20.2/ 蔗糖0.2moL 0.20.20.20.2020.20.20.20.20.2/ 加入蔗糖,立即摇匀开始计时,室温准确反应10min后,立即加碱性铜 试剂中止反应。 碱性铜试剂 01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 用保鲜膜封口,扎眼,沸水浴加热8mm,立即用自来水冷却。 磷钼酸试剂 1.01.01.01.01010101.01.01.01.01.0 5.0505.0505.05.05.05.0505.0505.0 u mol/min·ml Units/ml原始组 稀释后酶液的活力(按还原糖计算): A650×0.2×2 H moles E A650×10× b min x ml 式中:A650—第2~10管所测A50 A‘650—第12管所测A650 第12管葡萄糖取样量 标准葡萄糖浓度2mmoL=2μ mol/ml 10—反应10min B——每管加入酶液ml数 原始酶液的酶活力E=(平均E'/2)×稀释倍数( Units/ml原始组分) 八、计算各级分的比活力,纯化倍数及回收率,并将数据列于下表: 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据,对各个级分都必须取样,每取一次样 对于下一级分来说会损失一部分量,因而要对下一个级分的体积进行校正,以使回收率 的计算不致受到不利的影响
229 度（mg 蛋白/ml）为横座标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。 表 1 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称→ 对照 粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ 葡萄糖 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 酶液(ml) 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / H2O(ml) 0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8 乙酸缓冲液 (0.2mol/L pH4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 葡萄糖 2mmol/L / / / / / / / / / / / 0.2 蔗糖 0.2mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应 10min 后，立即加碱性铜 试剂中止反应。 碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热 8min，立即用自来水冷却。 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm E’=μmol/min·ml 平均 E’ μmol/min·ml Units/ml 原 始 组 分 稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： 式中： A650 ──第 2~10 管所测 A650 A’650──第 12 管所测 A650 0.2 ── 第 12 管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度 2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应 10min B ──每管加入酶液 ml 数 原始酶液的酶活力 E = (平均 E’/2)×稀释倍数（Units / ml 原始组分） 八、计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表： 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样， 对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率 的计算不致受到不利的影响。 ） μ（ ml moles A B A E = ' 10 min 0.2 2 ' 650 650