章 第三章蛋白质化学 课时 3.5 节 第三节 肽 第四节蛋白质的分子结构 1.掌握肽与肽键的定义与命名 2.掌据肽的重要性质 教学目的 3. 了解蛋白质一级结构的测定 掌握蛋白质一，二，三，四级结构，超二级结构，结构域的有关概念，α一螺旋 B-折叠的要点。 5.熟悉维系蛋白质结构的作用力。 6.了解一级结构测定进展。 1肚键的完义知命名 2,蛋白质 一级结构测定的一般程序，重点是N末端和C末端测定方法的原理：Edm 降解法 学 3.蛋白质一，二，三，四级结构，超二级结构，结构域的有关概念，ā-螺旋，B- 折叠的要点 点 1.蛋白质一级结构的测定 2.超二级结构，结构域的有关概念 学 难 点 相关素材（参考资料、指导学生阅读材料等）： 杨志敏，蒋立科.生物化学.高等教育出版社，2005,8 王镜岩，沈同.生物化学（第三版）.高等教有出版社，2003,5 古练权.生物化学.高等教有出版社，2000,7 徐风彩.基础生物化学.华南理工大学出版社，1999,8
章 第三章 蛋白质化学 课时 3.5 节 第三节 肽 第四节 蛋白质的分子结构 教 学 目 的 1． 掌握肽与肽键的定义与命名 2． 掌握肽的重要性质 3． 了解蛋白质一级结构的测定 4． 掌握蛋白质一，二，三，四级结构，超二级结构，结构域的有关概念，α-螺旋， β-折叠的要点。 5． 熟悉维系蛋白质结构的作用力。 6． 了解一级结构测定进展。 教 学 重 点 1． 肽键的定义和命名 2． 蛋白质一级结构测定的一般程序，重点是N末端和C末端测定方法的原理；Edman 降解法 3． 蛋白质一，二，三，四级结构，超二级结构，结构域的有关概念，α-螺旋，β- 折叠的要点 教 学 难 点 1．蛋白质一级结构的测定 2．超二级结构，结构域的有关概念 相关素材（参考资料、指导学生阅读材料等）： 杨志敏，蒋立科. 生物化学. 高等教育出版社，2005，8 王镜岩，沈同.生物化学（第三版）.高等教育出版社，2003，5 古练权. 生物化学. 高等教育出版社，2000，7 徐凤彩. 基础生物化学.华南理工大学出版社，1999，8
教师授课思路、设问及讲解要点 第三节肽 ,肽健与肽的概念 氨基酸的ā一羧基与另一个氨基酸的ā一氨基形成特殊的酰胺键，称为肽键。 氨基酸以肽键相连形成的化合物称为肽。（注：侧链基团上的氨基和羧基参与形成 的酰胺键称为异肽键。) 二、肽和肽键的结构及命名 (一)结构：肽键的结构如下图所示： 主链：由上图看出，多肽链的骨架由重复的肽单位排列而成，称为主链。 侧链：R基团。 肽单位（肽单元） 教 H3N+- -N-c-C00 程 (N-未端) 肽单位肽键 氨基酸残基 羧基未端 (C一未端 AA残基：由于形成肽键的a氨基与a羧基之间缩合释放出一分子水，肽链中的 AA己不是完整的分子，因而称为AA残基。 末端：通常肽链的一端含有一个游离的α氨基，称为氨基末端：另一端保留一个 游离的α羧基，称为羧基末端， 不同的多肽链氨基酸排列顺序不同(N一末端C一末端)，因而侧链R基团的 排列顺序不同。肽与蛋白质没有严格的区别，蛋白质是高分子量的多肽。 肽键的结构特点： (1)酰胺氯上的孤对电子与相邻羧基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性 (2)肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。 (3)肽键亚氨基在pH0-14内不解离
17 教 学 过 程 教师授课思路、设问及讲解要点 第三节 肽 一、肽键与肽的概念 氨基酸的α－羧基与另一个氨基酸的α－氨基形成特殊的酰胺键，称为肽键。 氨基酸以肽键相连形成的化合物称为肽。（注：侧链基团上的氨基和羧基参与形成 的酰胺键称为异肽键。） 二、肽和肽键的结构及命名 （一）结构：肽键的结构如下图所示： 主链：由上图看出，多肽链的骨架由重复的肽单位排列而成，称为主链。 侧链：R 基团。 肽单位（肽单元）： AA 残基：由于形成肽键的α-氨基与α-羧基之间缩合释放出一分子水，肽链中的 AA 已不是完整的分子，因而称为 AA 残基。 末端：通常肽链的一端含有一个游离的α-氨基，称为氨基末端；另一端保留一个 游离的α-羧基，称为羧基末端。 不同的多肽链氨基酸排列顺序不同（N—末端 C—末端），因而侧链 R 基团的 排列顺序不同。肽与蛋白质没有严格的区别，蛋白质是高分子量的多肽。 肽键的结构特点： （1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性 高。 （2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。 （3）肽键亚氨基在 pH0-14 内不解离
(4)肽链中的肽键一般是反式构型，而P©的肽键可能出现顺、反两种构型. (一)命名 一般由几个AA组成的肽称为几肽。常把12个氨基酸以下的短肽称为赛肽。常把 几十个氨基酸形成的肽叫做多肽。多肚与寡肽之间无严格界限， 小分子肽一般按其氨基羧残基排列顺序命名，如NScr-Gly-Ty-Ala-Leu或SG YAL,如果倒过来写，则表示不同的肽，如Leu一Ala-Tyr-Gy-Ser。 三、肽的重要性质 (一)旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短 肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。 (二)肽的酸碱性质 短肽在品体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 在pHO一l4范围内，肽键中的亚氢基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于N端a -NH,和C端a一COOH以及侧链R上可解离的基团。 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。 肽中的未端a一COOH pK值比游离aa中的大一些，而末端a一N*H,的pK值比 游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。 (三)肽的化学反应 和游离氨基酸一样，肽的α一羧基，α一氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与 游离氨基酸相似的反应。 凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应 是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。 四、重要的天然赛肽 第四节 蛋白质的分子结构 每种蛋白质在天然状态下都有一定的空间结构（构象），构象是比较稳定的，构象 稳定，才能保证蛋白质功能的稳定。目前己确认的蛋白质结构层次分为一级结构、 级结构、三级结构、四级结构。另外，为研究方便，在二、三级结构之间又划分出超 二级结构和结构域两个层次。 一、蛋白质的一级结构 (一)一级结构的含义和重要性 1、含义：指多肽链内氨基酸残基从N一末端到C一末端的排列顺序。一级结构也
18 （4）肽链中的肽键一般是反式构型，而 Pro 的肽键可能出现顺、反两种构型． （二）命名 一般由几个 AA 组成的肽称为几肽。常把 12 个氨基酸以下的短肽称为寡肽。常把 几十个氨基酸形成的肽叫做多肽。多肽与寡肽之间无严格界限。 小分子肽一般按其氨基羧残基排列顺序命名，如Ｎ Ser-Gly-Try-Ala-Leu 或ＳＧ ＹＡＬ，如果倒过来写，则表示不同的肽，如 Leu—Ala-Tyr-Gly-Ser。 三、肽的重要性质 （一） 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短 肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。 （二）肽的酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 在 pH0―14 范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α －ＮＨ２和Ｃ端α－COOH 以及侧链Ｒ上可解离的基团。 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。 肽中的末端α－COOH pK 值比游离 a.a 中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的 pK 值比 游离氨基酸中的小一些，R 基变化不大。 （三）肽的化学反应 和游离氨基酸一样，肽的α—羧基，α—氨基和侧链 R 基上的活性基团都能发生与 游离氨基酸相似的反应。 凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应 是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。 四、重要的天然寡肽 第四节 蛋白质的分子结构 每种蛋白质在天然状态下都有一定的空间结构（构象），构象是比较稳定的，构象 稳定，才能保证蛋白质功能的稳定。目前已确认的蛋白质结构层次分为一级结构、二 级结构、三级结构、四级结构。另外，为研究方便，在二、三级结构之间又划分出超 二级结构和结构域两个层次。 一、蛋白质的一级结构 （一）一级结构的含义和重要性 1、含义：指多肽链内氨基酸残基从 N－末端到 C－末端的排列顺序。一级结构也
称为氨基酸序列，是蛋白质最基本的结构。 注：过去曾将一级结构混同于化学结构。根据国际纯化学与应用化学联合会1969 年的规定。一级结构专指AA序列，而蛋白质的化学结构则包括肽链数目、端基组成 AA序列和二硫键的位置，又称共价结构。 2、重要性：蛋白质的一级结构决定其高级结构，高级结构决定蛋白质的性质与功 (二)一级结构测定的一般程序。(P38-39) 一般原则： (1)、先纯化蛋白质。 (2)、测定末端A4数目，确定蛋白质分子是由几条肚链构成的。 (3)、将蛋白质分子中的几条肽链拆开，并分离出每条肽链。 (4、将肽链完全水解，测定每条肽链的AA组成 (5)、测定每条肽链的N端和C端AA (6)、至少用两种方法将肽链水解成小的肽段。 (7)、分离并测定每条肽段氨基酸顺序」 (8)、通过比较（片段重叠法）确定多肽链的氨基酸顺序。 (三))蛋白质一级结构的测定 1.确定蛋白质的肽链数日 通过测定末端氨基酸残基的量与蛋白质相对分子质量之间的关系，即可确定多肽 链数目。 2.拆开二硫健并分离出每条多肽链 3.测定多肽链氨基酸组成 经分离提纯的多肽链一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成。 4.分析每条多肽链的N-末端和C-末端残基 取每条多肽链的部分样品进行N末端和C末端氨基酸的鉴定，以便建立两个重要 的氨基酸顺序参考点。 测定N末端氨基酸的方法有多种，常用的有二硝基氟苯(DNFB)法和异硫氰酸 苯酯(PTH)法（如氨基酸的化学性质中所介绍的）。其中异破氰酸苯酯法应用广泛， 并己根据其原理设计制造出氨基酸顺序分析仪。此外，还可以用丹磺酰氯(dansyl 19
19 称为氨基酸序列，是蛋白质最基本的结构。 注：过去曾将一级结构混同于化学结构。根据国际纯化学与应用化学联合会 1969 年的规定。一级结构专指 AA 序列，而蛋白质的化学结构则包括肽链数目、端基组成 AA 序列和二硫键的位置，又称共价结构。 2、重要性：蛋白质的一级结构决定其高级结构，高级结构决定蛋白质的性质与功 能 （二）一级结构测定的一般程序。（P38-39） 一般原则： （1）、先纯化蛋白质。 （2）、测定末端 AA 数目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的。 （3）、将蛋白质分子中的几条肽链拆开，并分离出每条肽链。 （4）、将肽链完全水解，测定每条肽链的 AA 组成。 （5）、测定每条肽链的 N 端和 C 端 AA （6）、至少用两种方法将肽链水解成小的肽段。 （7）、分离并测定每条肽段氨基酸顺序。 （8）、通过比较（片段重叠法）确定多肽链的氨基酸顺序。 (三) ）蛋白质一级结构的测定 1．确定蛋白质的肽链数目 通过测定末端氨基酸残基的量与蛋白质相对分子质量之间的关系，即可确定多肽 链数目。 2．拆开二硫键并分离出每条多肽链 3．测定多肽链氨基酸组成 经分离提纯的多肽链一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成。 4．分析每条多肽链的 N-末端和 C-末端残基 取每条多肽链的部分样品进行 N-末端和 C-末端氨基酸的鉴定，以便建立两个重要 的氨基酸顺序参考点。 测定 N-末端氨基酸的方法有多种，常用的有二硝基氟苯（DNFB）法和异硫氰酸 苯酯（PTH）法（如氨基酸的化学性质中所介绍的）。其中异硫氰酸苯酯法应用广泛， 并已根据其原理设计制造出氨基酸顺序分析仪。此外，还可以用丹磺酰氯（dansyl
chloiride,DNS-CL)法测定N-末端氨基酸。其原理是：多肽链N端氨基酸的氨基可与 5二甲氨基萘1-磺酰氯(DNS)反应，生成丹磺酰肽(DNS-肽)，此产物经酸水解产生 DNS-氨基酸（具有荧光）和其它游离的氨基酸。用乙酸乙酯抽提，可得到DNS氨基酸 然后可用色谱分析进行鉴定。 测定C末端氨基酸常用的方法有肼解法和还原法等。肼解法的原理为：多肽链和 过量的无水肼在100C反应5~10h,所有肽键被水解，除C-末端氨基酸自由存在外， 其他氨基酸都转变为氨基酸酰肼。向反应体系中加入苯甲醛，氨基酸酰肼转变为不溶 于水的二苯基行生物，离心分离后C末端氨基酸在水相，向水相中加入2,4二硝基氟 苯，使其与C端氨基酸反应，经色谱分析可鉴定其种类。 还原法原理为：肽链C-末端氨基酸可被氢硼化锂还原成相应的ā·氨基醇，肽链完 全水解后，此ā氨基醇可用层析法鉴定，从而确定C末端氨基酸的种类。 5.用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离 将每条多肽链用两种不同方法进行部分水解，这是一级结构测定中的关键步骤。 目前用于顺序分析的方法一次能测定的顺序都不太长，然而天然的蛋白质分子大多在 100个残基以上，因此必须设法将多肽断裂成较小的肽段，以便测定每个肽段的氨基酸 顺序。 6.测定各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序 多肽链部分水解后分离得到的各个肚段需进行氨基酸列顺序的测定，序列测定 可用氨基酸序列分析仪。然后用重叠顺序法将两种水解方法得到的两套肽段的氨基酸 顺序进行比较分析，根据交叉重叠部分的顺序推导出完整肽链的氨基酸顺序。 7.二疏键位置的确定 蛋白质分子中二硫键位置的确定也是以氨基酸的测序技术为基础的。这一步骤名 往在确定了蛋白质的氨基酸顺序后再进行。其基本步骤是：根据已知氨基酸顺序选择 合适的专一性蛋白水解酶，在不打开二硫键的情况下部分水解蛋白质，将水解得到的 肽段进行分离。将分离得到的含有二硫健的肽段进行氧化或还原，切断二硫健。分离 切断二硫键以后生成的两个肽段，并确定这两个肽段的氨基酸顺序。将这两个肽段的 氨基酸顺序与多肽链的氨基酸顺序比较，即可推断出二硫键的位置。 二、蛋白质的构象和维持构象的作用力 根据X一射线衍射研究，蛋白质的多肽链并非线性伸展的，而是以一定的方式折
20 chloiride, DNS-CL）法测定 N-末端氨基酸。其原理是：多肽链 N 端氨基酸的氨基可与 5-二甲氨基萘-1-磺酰氯（DNS）反应，生成丹磺酰肽（DNS-肽），此产物经酸水解产生 DNS-氨基酸（具有荧光）和其它游离的氨基酸。用乙酸乙酯抽提，可得到 DNS-氨基酸， 然后可用色谱分析进行鉴定。 测定 C-末端氨基酸常用的方法有肼解法和还原法等。肼解法的原理为：多肽链和 过量的无水肼在 100℃反应 5～10h，所有肽键被水解，除 C-末端氨基酸自由存在外， 其他氨基酸都转变为氨基酸酰肼。向反应体系中加入苯甲醛，氨基酸酰肼转变为不溶 于水的二苯基衍生物，离心分离后 C-末端氨基酸在水相，向水相中加入 2,4-二硝基氟 苯，使其与 C-端氨基酸反应，经色谱分析可鉴定其种类。 还原法原理为：肽链 C-末端氨基酸可被氢硼化锂还原成相应的α-氨基醇，肽链完 全水解后，此α-氨基醇可用层析法鉴定，从而确定 C-末端氨基酸的种类。 5．用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离 将每条多肽链用两种不同方法进行部分水解，这是一级结构测定中的关键步骤。 目前用于顺序分析的方法一次能测定的顺序都不太长，然而天然的蛋白质分子大多在 100 个残基以上，因此必须设法将多肽断裂成较小的肽段，以便测定每个肽段的氨基酸 顺序。 6．测定各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序 多肽链部分水解后分离得到的各个肽段需进行氨基酸排列顺序的测定，序列测定 可用氨基酸序列分析仪。然后用重叠顺序法将两种水解方法得到的两套肽段的氨基酸 顺序进行比较分析，根据交叉重叠部分的顺序推导出完整肽链的氨基酸顺序。 7．二硫键位置的确定 蛋白质分子中二硫键位置的确定也是以氨基酸的测序技术为基础的。这一步骤往 往在确定了蛋白质的氨基酸顺序后再进行。其基本步骤是：根据已知氨基酸顺序选择 合适的专一性蛋白水解酶，在不打开二硫键的情况下部分水解蛋白质，将水解得到的 肽段进行分离。将分离得到的含有二硫键的肽段进行氧化或还原，切断二硫键。分离 切断二硫键以后生成的两个肽段，并确定这两个肽段的氨基酸顺序。将这两个肽段的 氨基酸顺序与多肽链的氨基酸顺序比较，即可推断出二硫键的位置。 二、蛋白质的构象和维持构象的作用力 根据 X—射线衍射研究，蛋白质的多肽链并非线性伸展的，而是以一定的方式折