2.探针标记方法的选择 3 5 模板DNA (1)随机引物标记（单链） 变性 (random priming) 31 5 加入随机引物 变性DNA DNA样品经过变性与随机序列的 31 短引物杂交，在标记dNTP存在 -51 的条件下，DNA聚合酶I催化引 DNA聚合酶 ,dNTPs(一种被标记) 物延伸产生标记产物 5 3 只&从-e 3. -5 当以RNA为模板时，必须采用反转 变性 录酶，得到的产物是标记的单链 9只之 aaas wads e总&从点 标记探针 《从息 cDNA探针 起始模板 引物 标记探针QQ息 临床分子生物学检验技术
(1)随机引物标记(单链) (random priming) DNA样品经过变性与随机序列的 短引物杂交，在标记dNTP存在 的条件下，DNA聚合酶Ⅰ催化引 物延伸产生标记产物 当以RNA为模板时，必须采用反转 录酶，得到的产物是标记的单链 cDNA探针
-3 (2)DNA缺口平移标记 .5 模板DNA (nick translation) DNaseI Mg 5 35 35 3 3 带缺口的双链NA -53 53 依赖于ONase I和DNA DNA聚合酶缸 dNTPs(一种被标记) 聚合酶I的协同作用 只要标记一种dNTP,就可 以对DNA进行全程标记。 5及&w35'—及&&3 3及及5及众众5 标记探针 临床分子生物学检验技术
(nick translation) 依赖于DNaseⅠ和DNA 聚合酶Ⅰ的协同作用 只要标记一种dNTP，就可 以对DNA进行全程标记
启动子SP6 启动千T7 (3)全程RNM 目的基因 双向载体 w 最常用的 彼此被多 SP6 个克隆位点分 义的RNA 探针。质粒消 在△处酶切 在◆处酶切 专录。 SP6 T7RNA聚合酶 SP6RNA聚合酶 从T7启动子转录 NTP(一种被标记) NTP(一种被标记) 从SP6启动子转录 3' 临床分子生物学检验技术
(3)全程RNA探针标记 最常用的载体：含两种转录方向相反启动子，并且彼此被多 个克隆位点分开，从而可以在一个质粒中获得正义或反义的RNA 探针。质粒消化为线性，在标记NTP存在的情况下进行转录