第四章 培养基及其制备 第一节 原料 一、原料的定义及选择 （一）原料的定义 从工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可 作为发酵工业生产的原料。（二）选择原料的依据 1，原料选择的原则 选择淀粉质原料生产酒精时，从工艺的角度着眼，凡任何含有可发酵性糖或可变为发酵 糖的原料，都可作为酒精生产的原料。对于工业上大规模投入生产的原料，除了要提出工艺 上的要求外，还要提出生产管理和经济上的要求，因此，在选择工业上大规模生产酒精的原 料时，应考虑到下列诸条件： （1）因地制宜，就地取材，原料产地离工厂要近，便于运输，节省费用。 （2）要求原料内碳水化合物含量较多，蛋白质含量要适当，适合与微生物的需要和吸收利 用。 （3）原料资源要丰富，容易收集。由于酒精生产需要大量原料，要保证一定的库存量。 （4）原料要容易贮藏。应考虑到新鲜原料内含水量多，不耐久藏，最好选择经，干燥后， 含水极少的干原料，易与保藏，不宜霉烂。 （5）对人民的身体无寻损害，影响发酵过程的杂质含量因应当极少，或者几乎不含。 （6）原料价格低廉，可降低产品成本。 此外，还应当考虑到大力节约粮食原料，尽量少用或不用粮食原料，充分利用当地的非粮食 原料，广泛利用野生植物原料，同时利用农林副产物和植物纤维原料，以及亚硫酸盐纸浆废 液等，对于节约粮食原料有着重要意义。另外，利用石油原料化学合成制造酒精，也是发展 酒精的主要途径。 2，在确定原料选择原则时需注意的问题（1）所选用的培养基与所使用的发酵器的结构 有关。例如 ICI 公司因指定用甲醇和氨生产单细胞蛋白质而另行设计新的发酵罐。同样的理 由，在一个巳设定的发酵罐中，发酵必然会受到培养基组份改变的影响。 （2）从实验室规模放大到实验工厂规模，以至于放大到工业生产规模，都要考虑培养 基的组份的变化。 （3）培养基的组成，除了考虑到菌体生长和产物的形成的需要外，还要考虑到培养基 的 pH 变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态等，而且还有前体和代谢抑制剂的 需要。 二、常用主要原料及其化学组成（一）原料的种类 发酵生产的原料，一般可分成下列几类： 1，薯类：甘薯、马铃薯、木薯、山药等。 2，粮谷类：高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。 3，野生植物 橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等。 4，农产品加工副产物 米粞、米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。 （二）常用原料的化学组成 原料所含的化学成分，不仅关系着生产率的高低，同时也影响生产的工艺过程。常用原 料中主要的化学成分如下： 碳水化学物：原料中所含的淀粉，或与淀粉类似的菊糖、蔗糖、麦芽糖、果糖及葡萄糖 等，这些物质都可以发酵生成产品，同时也是霉菌和酵母的营养及能源，原料中含这些物质
第四章 培养基及其制备 第一节 原料 一、原料的定义及选择 （一）原料的定义 从工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可 作为发酵工业生产的原料。（二）选择原料的依据 1，原料选择的原则 选择淀粉质原料生产酒精时，从工艺的角度着眼，凡任何含有可发酵性糖或可变为发酵 糖的原料，都可作为酒精生产的原料。对于工业上大规模投入生产的原料，除了要提出工艺 上的要求外，还要提出生产管理和经济上的要求，因此，在选择工业上大规模生产酒精的原 料时，应考虑到下列诸条件： （1）因地制宜，就地取材，原料产地离工厂要近，便于运输，节省费用。 （2）要求原料内碳水化合物含量较多，蛋白质含量要适当，适合与微生物的需要和吸收利 用。 （3）原料资源要丰富，容易收集。由于酒精生产需要大量原料，要保证一定的库存量。 （4）原料要容易贮藏。应考虑到新鲜原料内含水量多，不耐久藏，最好选择经，干燥后， 含水极少的干原料，易与保藏，不宜霉烂。 （5）对人民的身体无寻损害，影响发酵过程的杂质含量因应当极少，或者几乎不含。 （6）原料价格低廉，可降低产品成本。 此外，还应当考虑到大力节约粮食原料，尽量少用或不用粮食原料，充分利用当地的非粮食 原料，广泛利用野生植物原料，同时利用农林副产物和植物纤维原料，以及亚硫酸盐纸浆废 液等，对于节约粮食原料有着重要意义。另外，利用石油原料化学合成制造酒精，也是发展 酒精的主要途径。 2，在确定原料选择原则时需注意的问题（1）所选用的培养基与所使用的发酵器的结构 有关。例如 ICI 公司因指定用甲醇和氨生产单细胞蛋白质而另行设计新的发酵罐。同样的理 由，在一个巳设定的发酵罐中，发酵必然会受到培养基组份改变的影响。 （2）从实验室规模放大到实验工厂规模，以至于放大到工业生产规模，都要考虑培养 基的组份的变化。 （3）培养基的组成，除了考虑到菌体生长和产物的形成的需要外，还要考虑到培养基 的 pH 变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态等，而且还有前体和代谢抑制剂的 需要。 二、常用主要原料及其化学组成（一）原料的种类 发酵生产的原料，一般可分成下列几类： 1，薯类：甘薯、马铃薯、木薯、山药等。 2，粮谷类：高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。 3，野生植物 橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等。 4，农产品加工副产物 米粞、米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。 （二）常用原料的化学组成 原料所含的化学成分，不仅关系着生产率的高低，同时也影响生产的工艺过程。常用原 料中主要的化学成分如下： 碳水化学物：原料中所含的淀粉，或与淀粉类似的菊糖、蔗糖、麦芽糖、果糖及葡萄糖 等，这些物质都可以发酵生成产品，同时也是霉菌和酵母的营养及能源，原料中含这些物质
越多，生成酒精也就越多，所以它和产量有着密切的关系。碳水化合物中的五碳糖多存在于 原料的皮层，如麸皮、高粱糠，谷糠、花生壳等都含有很多，它不但影响淀粉数字偏高，发 酵中也易生成有害的糠醛。纤维素虽属于碳水化合物，但不被淀粉水解，只起填充作用，对 于发酵没有什么直接影响。 蛋白质：原料含有的蛋白质，在发酵生产过成中，经蛋白酶水解后，可为微生物生长繁 殖的重要营养成分，而微生物细胞中，30~50%（干重）是蛋白质。一般的说，当培养基内 氮的含量适当，则微生物生长旺盛，酶的含量也较高。有些原料所含蛋白质有时不能满足微 生物生长和繁殖的要求，则应从外界加入氮源。蛋源一般包括有机蛋源和无机氮源两种，根 据不同情况，添加不同种类的氮源。 脂肪：对发酵有影响，如高粱糠、米糠等含油脂多，则生酸较快，生酸幅度也较大。一 些发酵厂如采用玉米作为原料，总是把玉米坯芽除去。 灰分：灰分中的磷、硫、镁、钾、钙等是构成菌体系胞的和辅霉的重要成分，还有调节 渗透压的作用，是微生物生长不可却少的，在一般原料中，灰分的含量一足够。 三、工业发酵培养基的设计 1，为何要进行培养基的设计？ 完善的培养基设计是实验室的试验、实验工厂和生产规模的放大中的一个重要步骤。在 发酵过程中，我们的目的产品是菌体或代谢产物。而发酵培养基是否适合于菌体的生长或积 累代谢产物，对最终产品的得率具有非常大的影响。2，培养基设计的基本原则 培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素，并能提供生物合成和细胞维 持活力所需要的能量。3，如何进行培养基的设计 （1）作出细胞生长和产物形成的化学计算的平衡 碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物+CO2+H2O++热量 通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需的营养物的最低数量。在了解一定数量的 生物体所能产生的产物数量后；就有可能计算出形成产物时所需的底物数量。这些培养基的 组份的数量仅仅是供给细胞形成产物，而不包括生成细胞所需的营养。所有上述各项数量， 是不易获得其精确的数字。（2）组成微生物的元素包括 C、H、O、N、S、P、Mg 和 K（见下 表），这些元素都要在方程式中予以平衡 细菌、酵母和真菌的元素组成(按干重％计) 在培养基中有些元素的含量往往超过需要量，如 P 和 K。而其它元素含量则接近最低值 (如 Zn，Cu 等)。在许多培养基中增加磷酸盐浓度，其用意是增加培养基的缓冲容量，这一 点，在设计培养基时要引起注意。 （3）有些微生物无力的合成特定营养物，如氨基酸、维生素或核苷酸。一旦测出其中 一种是生长因子，就要在培养基中加入适量的纯净的化合物或含有该物质的混合物。（4）碳 源具有生物合成的底物和能源的双重作用，在需氧条件下，对碳源的需要量可以从菌体对底 物的产率系数(Yx/s)推算而得。该系数的定义是：细胞干物质的产量／碳源底物的被利用量 下表中列出了一些 Yx/s 值。如以葡萄糖为底物时，其 Y 值为 0.5g 即表示每 1g 葡萄糖 能生成 0.5g 细胞干物质。为要获得 30gdm-3 浓度的细胞，需要葡萄糖 30／0.5＝60gdm-3
越多，生成酒精也就越多，所以它和产量有着密切的关系。碳水化合物中的五碳糖多存在于 原料的皮层，如麸皮、高粱糠，谷糠、花生壳等都含有很多，它不但影响淀粉数字偏高，发 酵中也易生成有害的糠醛。纤维素虽属于碳水化合物，但不被淀粉水解，只起填充作用，对 于发酵没有什么直接影响。 蛋白质：原料含有的蛋白质，在发酵生产过成中，经蛋白酶水解后，可为微生物生长繁 殖的重要营养成分，而微生物细胞中，30~50%（干重）是蛋白质。一般的说，当培养基内 氮的含量适当，则微生物生长旺盛，酶的含量也较高。有些原料所含蛋白质有时不能满足微 生物生长和繁殖的要求，则应从外界加入氮源。蛋源一般包括有机蛋源和无机氮源两种，根 据不同情况，添加不同种类的氮源。 脂肪：对发酵有影响，如高粱糠、米糠等含油脂多，则生酸较快，生酸幅度也较大。一 些发酵厂如采用玉米作为原料，总是把玉米坯芽除去。 灰分：灰分中的磷、硫、镁、钾、钙等是构成菌体系胞的和辅霉的重要成分，还有调节 渗透压的作用，是微生物生长不可却少的，在一般原料中，灰分的含量一足够。 三、工业发酵培养基的设计 1，为何要进行培养基的设计？ 完善的培养基设计是实验室的试验、实验工厂和生产规模的放大中的一个重要步骤。在 发酵过程中，我们的目的产品是菌体或代谢产物。而发酵培养基是否适合于菌体的生长或积 累代谢产物，对最终产品的得率具有非常大的影响。2，培养基设计的基本原则 培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素，并能提供生物合成和细胞维 持活力所需要的能量。3，如何进行培养基的设计 （1）作出细胞生长和产物形成的化学计算的平衡 碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物+CO2+H2O++热量 通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需的营养物的最低数量。在了解一定数量的 生物体所能产生的产物数量后；就有可能计算出形成产物时所需的底物数量。这些培养基的 组份的数量仅仅是供给细胞形成产物，而不包括生成细胞所需的营养。所有上述各项数量， 是不易获得其精确的数字。（2）组成微生物的元素包括 C、H、O、N、S、P、Mg 和 K（见下 表），这些元素都要在方程式中予以平衡 细菌、酵母和真菌的元素组成(按干重％计) 在培养基中有些元素的含量往往超过需要量，如 P 和 K。而其它元素含量则接近最低值 (如 Zn，Cu 等)。在许多培养基中增加磷酸盐浓度，其用意是增加培养基的缓冲容量，这一 点，在设计培养基时要引起注意。 （3）有些微生物无力的合成特定营养物，如氨基酸、维生素或核苷酸。一旦测出其中 一种是生长因子，就要在培养基中加入适量的纯净的化合物或含有该物质的混合物。（4）碳 源具有生物合成的底物和能源的双重作用，在需氧条件下，对碳源的需要量可以从菌体对底 物的产率系数(Yx/s)推算而得。该系数的定义是：细胞干物质的产量／碳源底物的被利用量 下表中列出了一些 Yx/s 值。如以葡萄糖为底物时，其 Y 值为 0.5g 即表示每 1g 葡萄糖 能生成 0.5g 细胞干物质。为要获得 30gdm-3 浓度的细胞，需要葡萄糖 30／0.5＝60gdm-3
在发酵过程中，适当地补充碳源是必要的。将碳源转化成产物的观察值与理论上最大值 之间进行比较，才能进行深入的研究。但由于对生物合成的知识的限制而难以作出精密的分 析。Cooney(1979)以青霉素生物合成的途径为基础，通过物质和能量平衡，计算出青霉素生 物合成的理论值。总的化学计算式为 方程式中的 a2、b2、c2、d2、e2、nz、p2 和 q2 都是 化学计算中的系数，PAA 代表苯乙酸。解方程式．得：按上述方程式计算每 1g 葡萄糖能产 生 1.1g 苄青霉素的理论值。在青霉素分批发酵的一个简单模型中，用于合成细胞、维持生 命活力和转化成青霉素的葡萄糖，分别占总糖耗量的 28、61 和 11％。在分批补料发酵时， 则 26％的葡萄糖用于生长、70％用于维持生命、6％用于合成青霉素。每克葡萄糖的最大青 霉素转化产量为 0.0538，这个理论值数倍于实验值。4，发酵培养基的组成成分 （1）水 （2）碳源 ⚫ 影响选择碳源的因素： ⚫ 原料成本占生产总成本的比例； ⚫ 在某些发酵过程中，必须除去碳源中的杂质； ⚫ 对碳源的选择，往往还受到政府政策的影响； ⚫ 当地的法律条例指定了许多饮料业所使用的底物； ⚫ 培养基的配制方法，特别是灭菌方法。（3）氮源 （4）无机盐 （5）维生素 （6）缓冲剂 控制 pH 时对获得最佳生产能力是十分重要的。在培养基中加入一种化合物作为缓冲剂 或同时可作为营养源。许多种培养基多加入碳酸钙作为缓冲剂，以达到 pH7．0 左右。如果 pH 下降，则碳酸钙分解，如果是 pH 上升，可以自然地校正微生物的产酸量。在许多培养 基中，也用磷酸盐作为重要的缓冲剂。 碳源和氮源的平衡，也是控制 pH 的一种方式。在玉米浆中的蛋白质、肽、氨基酸等也 具有缓冲容量。滴加氨，氢氧化钠和硫酸，可以严格地控制 pH 值。 （7）前体和代谢调节 剂 （8）消沫剂 第二节 原料处理 一、预处理的必要性 1，发酵工厂在进行生产前，必须先将原料中混杂的小铁钉、杂草、泥快和石头等杂质除去， 保证后续工序生产的正常和顺利进行。 2，为保证后续工序生产的正常和顺利进行，还需对原料进行适当加工。 a2C6H12O6 +b2NH3 + c2O2 + d2H2SO4 + e2PAA→ n2卞青霉素+ p2CO2 + q2H2O 10 6C6H12O6 + 2NH3 + 1 2O2 + H2SO4 +C8H8O2 →C18H18O4N2S + 2CO2 +9H2O
在发酵过程中，适当地补充碳源是必要的。将碳源转化成产物的观察值与理论上最大值 之间进行比较，才能进行深入的研究。但由于对生物合成的知识的限制而难以作出精密的分 析。Cooney(1979)以青霉素生物合成的途径为基础，通过物质和能量平衡，计算出青霉素生 物合成的理论值。总的化学计算式为 方程式中的 a2、b2、c2、d2、e2、nz、p2 和 q2 都是 化学计算中的系数，PAA 代表苯乙酸。解方程式．得：按上述方程式计算每 1g 葡萄糖能产 生 1.1g 苄青霉素的理论值。在青霉素分批发酵的一个简单模型中，用于合成细胞、维持生 命活力和转化成青霉素的葡萄糖，分别占总糖耗量的 28、61 和 11％。在分批补料发酵时， 则 26％的葡萄糖用于生长、70％用于维持生命、6％用于合成青霉素。每克葡萄糖的最大青 霉素转化产量为 0.0538，这个理论值数倍于实验值。4，发酵培养基的组成成分 （1）水 （2）碳源 ⚫ 影响选择碳源的因素： ⚫ 原料成本占生产总成本的比例； ⚫ 在某些发酵过程中，必须除去碳源中的杂质； ⚫ 对碳源的选择，往往还受到政府政策的影响； ⚫ 当地的法律条例指定了许多饮料业所使用的底物； ⚫ 培养基的配制方法，特别是灭菌方法。（3）氮源 （4）无机盐 （5）维生素 （6）缓冲剂 控制 pH 时对获得最佳生产能力是十分重要的。在培养基中加入一种化合物作为缓冲剂 或同时可作为营养源。许多种培养基多加入碳酸钙作为缓冲剂，以达到 pH7．0 左右。如果 pH 下降，则碳酸钙分解，如果是 pH 上升，可以自然地校正微生物的产酸量。在许多培养 基中，也用磷酸盐作为重要的缓冲剂。 碳源和氮源的平衡，也是控制 pH 的一种方式。在玉米浆中的蛋白质、肽、氨基酸等也 具有缓冲容量。滴加氨，氢氧化钠和硫酸，可以严格地控制 pH 值。 （7）前体和代谢调节 剂 （8）消沫剂 第二节 原料处理 一、预处理的必要性 1，发酵工厂在进行生产前，必须先将原料中混杂的小铁钉、杂草、泥快和石头等杂质除去， 保证后续工序生产的正常和顺利进行。 2，为保证后续工序生产的正常和顺利进行，还需对原料进行适当加工。 a2C6H12O6 +b2NH3 + c2O2 + d2H2SO4 + e2PAA→ n2卞青霉素+ p2CO2 + q2H2O 10 6C6H12O6 + 2NH3 + 1 2O2 + H2SO4 +C8H8O2 →C18H18O4N2S + 2CO2 +9H2O
3，为保证生产环境的清洁，必须采用适当的输送方式将原料从仓库运送至配料罐或反应器。 二、预处理的方法（方式）（一）原料除杂 1，筛选、风选 气流-筛式分离机：这类分离机主要用于谷物原料除杂用。凡是厚度和宽度或空气动力 学性质(悬浮速度)与所用谷物不同的杂质，都可用气流-筛式分离机将其分离。 2，磁力除铁包括永久性磁力除铁器和电磁除铁器两种方式
3，为保证生产环境的清洁，必须采用适当的输送方式将原料从仓库运送至配料罐或反应器。 二、预处理的方法（方式）（一）原料除杂 1，筛选、风选 气流-筛式分离机：这类分离机主要用于谷物原料除杂用。凡是厚度和宽度或空气动力 学性质(悬浮速度)与所用谷物不同的杂质，都可用气流-筛式分离机将其分离。 2，磁力除铁包括永久性磁力除铁器和电磁除铁器两种方式
（二）原料的粉碎 1，原料粉碎的目的 把原料进行粉碎后成为粉末原料，其目的是要增加原料受热面积，有利于淀粉颗粒的吸 水膨涨、糊化，提高热处理效率，缩短热处理时间。另外，粉末状原料加水混合后容易流动 输送。 对于一些带壳的原料，如高粱、大麦，在粉碎前，则要求先把皮壳破碎，除去皮壳后在 形粉碎。如果不把皮壳原料的外层去掉，有如下几个缺点： （1）皮壳本身毫无营养价值，在发酵过程中对微生物没有好处，皮壳在醪液中会引起 阻碍液体的流动。 （2）皮壳在生产过程中，不发生变化，而大量皮壳汇集起来会占据一定的有效容积， 无形中降低了设备的生产能力。 （3）醪液糖化后进行发酵时，皮壳会聚集在液面上，而引起较厚的醪盖，醪盖的形成 会妨碍热量的逸散和 CO2 的放出，致使液体温度升高，细菌容易繁殖，特别是醋酸菌，出 现这些现象，都会对发酵带来不利。 （4）皮壳会使蒸馏塔及冷却器等设备发生阻塞。皮壳渐多，需要停机清理，会给生产 带来损失。 一般对于带皮壳的原料，处理过程要先行破碎，脱去皮壳。 2，原料粉碎的力学分析 固体物料的粉碎按其受力情况可分为： （1）挤压粉碎 （2）冲击粉碎 （3）研磨粉碎 （4）剪切粉碎 （5）劈裂粉碎
（二）原料的粉碎 1，原料粉碎的目的 把原料进行粉碎后成为粉末原料，其目的是要增加原料受热面积，有利于淀粉颗粒的吸 水膨涨、糊化，提高热处理效率，缩短热处理时间。另外，粉末状原料加水混合后容易流动 输送。 对于一些带壳的原料，如高粱、大麦，在粉碎前，则要求先把皮壳破碎，除去皮壳后在 形粉碎。如果不把皮壳原料的外层去掉，有如下几个缺点： （1）皮壳本身毫无营养价值，在发酵过程中对微生物没有好处，皮壳在醪液中会引起 阻碍液体的流动。 （2）皮壳在生产过程中，不发生变化，而大量皮壳汇集起来会占据一定的有效容积， 无形中降低了设备的生产能力。 （3）醪液糖化后进行发酵时，皮壳会聚集在液面上，而引起较厚的醪盖，醪盖的形成 会妨碍热量的逸散和 CO2 的放出，致使液体温度升高，细菌容易繁殖，特别是醋酸菌，出 现这些现象，都会对发酵带来不利。 （4）皮壳会使蒸馏塔及冷却器等设备发生阻塞。皮壳渐多，需要停机清理，会给生产 带来损失。 一般对于带皮壳的原料，处理过程要先行破碎，脱去皮壳。 2，原料粉碎的力学分析 固体物料的粉碎按其受力情况可分为： （1）挤压粉碎 （2）冲击粉碎 （3）研磨粉碎 （4）剪切粉碎 （5）劈裂粉碎