第九章高效液相色谱实验技术 1高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的? 解气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件,从它的高效、高速和高 灵敏渡得到启发,采用5一10四微粒出定相以提高柱效,采用高压泵加快液体流动相的流 速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器,提高检测灵敏度,克服经典液 相色谱曲缺点,从而达到高效、快速、灵敏 2与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足 解气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。因此它只限于 分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。而高效液相色谱由于以液体作为流动相,只 要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度,便可以分析,所以适用性广,不受样品 挥发性和热稳定性的限制,特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物,例如 生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。在目前已知的有机化台物中, 只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离,80%的有机化合物要用高效液 相色谱分析 气相色谱中流动相是惰性的,它对组分没有作用力,仅起运载作用、而高效液相色谱 的流动相不仅起运载作用,而且流动相对组分有一定亲合力,可以通过改变流动相种类和组 成提高分离的选择性,另外可作流动相的化合物多,选择余地广 与气相色谱相比,高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易,只要开口容器 放在柱子末端,就可以很容易地将所分离的各组分收集。回收是定量的,可以用来提纯和制 备具有足够纯度的单一物质 高效液相色谱不足的是,日前检测器的灵敏度不及气相色谱。必须特别注意“柱外效 应”对柱效率及色谱分离的影响。 3试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线,分析产生不同的原因。 GC LC U 解从图可看出,气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线,形状迥然不同,流动相的流 速对柱效的影响也不一样,在气相色谱的H-u曲线上,塔板高度H随u变化呈双曲线.曲 线有一最低点,这时柱效最高,板髙最小,流速最佳。而液相色谱H-u曲线,未出现流速 降低板高増加的现象,由于最佳流速趋近于零,一般观察不到最低板高相对应的最佳流速 在正常的情况下,流速降低,板高H总是降低的,这与气相色谱明显不同。在气相色谱中
第九章 高效液相色谱实验技术 1 高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的? 解 气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高 灵敏渡得到启发，采用 5 一 10 四微粒出定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流 速；设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液 相色谱曲缺点，从而达到高效、快速、灵敏。 2 与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足? 解 气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。因此它只限于 分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。而高效液相色谱由于以液体作为流动相，只 要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度，便可以分析，所以适用性广，不受样品 挥发性和热稳定性的限制，特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如， 生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。在目前已知的有机化台物中， 只有 20％样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80％的有机化合物要用高效液 相色谱分析。 气相色谱中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱 的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组 成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物多，选择余地广。 与气相色谱相比，高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易，只要开口容器 放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。回收是定量的，可以用来提纯和制 备具有足够纯度的单一物质。 高效液相色谱不足的是，日前检测器的灵敏度不及气相色谱。必须特别注意“柱外效 应”对柱效率及色谱分离的影响。 3 试比较气相色谱与液相色谱的 H-u 曲线，分析产生不同的原因。 解 从图可看出，气相色谱和液相色谱得到的 H-u 曲线，形状迥然不同，流动相的流 速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的 H-u 曲线上，塔板高度 H 随 u 变化呈双曲线．曲 线有一最低点，这时柱效最高，板高最小，流速最佳。而液相色谱 H-u 曲线，未出现流速 降低板高增加的现象，由于最佳流速趋近于零，一般观察不到最低板高相对应的最佳流速。 在正常的情况下，流速降低，板高 H 总是降低的，这与气相色谱明显不同。在气相色谱中
流动相流速増大,柱效呈直线降低,而在液相色谱中,流动相流速増大,柱效平缓降低。其 主要原因是液相色谱的流动相为液体,液相的扩散系数Dm很小,通常仅为气相扩散系数的 104~-105分之一,所以分子扩散项在低u时也不起多大作用、因此液相色谱H-u曲线未能出 现流速降低,板髙增加现象。到高速时,虽然柱内线速提高,但固定相和流动相的传质都能 很快进行,故H-u曲线上升缓慢。 4简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素,如何减少谙带 扩张、提高柱效? 解液相色谱中引起色诺峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及 柱外效应。 在液相色谱中要减小谱带扩张,提高柱效,要减少续料颗粒直径,减小境料孔穴深度,提高 装填的均匀性,采用低粘度溶剂作流动相,流速尽可能低,同时要尽可能采用死体积较小的 进样器、检测器、接头和传输管线等。 5为什么要提出折合参数?有何特点? 解我们知道色谱操作条件对板高是有影响的. Giddings发现,固定相相同,填充良好, 共是粒度d不同,因而H-u曲线不同,在液相色谱中,培板高度是粒度的函数,为了比较 不向色谱条件下的板髙H.提出折合参数,包括折合板高、折合流速、折合柱长。其特点是 对于不同粒度的填料能得到相同的H-u曲线,因此可以在相同的条件下比较不同填料的柱 6色谱柱A长度为15cm,载体粒度为5μm.另一B柱长 为30cm,载体粒度为10μm,两柱的柱效相等吗? .l 15 0.000550000 30000 0.0010 A柱的折合柱长为300,B柱的折合柱长也为30000,表明组分在两根柱内从柱人口 到出口都经过30000个载体颗粒.两校的柱效相等。 7何谓梯度淋洗,适用于哪些样品的分析?与程序升温有什么
流动相流速增大，柱效呈直线降低，而在液相色谱中，流动相流速增大，柱效平缓降低。其 主要原因是液相色谱的流动相为液体，液相的扩散系数 Dm很小，通常仅为气相扩散系数的 104~105 分之一，所以分子扩散项在低 u 时也不起多大作用、因此液相色谱 H-u 曲线未能出 现流速降低，板高增加现象。到高速时，虽然柱内线速提高，但固定相和流动相的传质都能 很快进行，故 H-u 曲线上升缓慢。 4 简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谙带 扩张、提高柱效? 解 液相色谱中引起色诺峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及 柱外效应。 在液相色谱中要减小谱带扩张，提高柱效，要减少续料颗粒直径，减小境料孔穴深度，提高 装填的均匀性，采用低粘度溶剂作流动相，流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的 进样器、检测器、接头和传输管线等。 5 为什么要提出折合参数?有何特点？ 解 我们知道色谱操作条件对板高是有影响的．Giddings 发现，固定相相同，填充良好， 共是粒度 dp 不同，因而 H-u 曲线不同，在液相色谱中，培板高度是粒度的函数，为了比较 不向色谱条件下的板高 H．提出折合参数，包括折合板高、折合流速、折合柱长。其特点是 对于不同粒度的填料能得到相同的 H—ur 曲线，因此可以在相同的条件下比较不同填料的柱 效。 6 色谱柱 A 长度为 15cm，载体粒度为 5 m．另一 B 柱长 为 30cm，载体粒度为 10 m，两柱的柱效相等吗? 解 ∵ p d L l = ∴ 30000 0.0005 15 l A = = 30000 0.0010 30 l B = = A 柱的折合柱长为 30000，B 柱的折合柱长也为 30000，表明组分在两根柱内从柱人口 到出口都经过 30000 个载体颗粒．两校的柱效相等。 7 何谓梯度淋洗，适用于哪些样品的分析?与程序升温有什么
不同? 解梯度淋洗就是在分离过程中.让流动相的组成、极性、pl值等按‘定程序连续变 化。使样品中各组分能在最佳的k下出峰。使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分,保 留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离,特别适合样品中组分的k值范围很宽的复杂 样品的分析。梯度淋洗十分类似气相色谱的程序升温,两者的目的相同。不同的是程序升温 是通过程序改变柱温。而液相色谱是通过改变流动相组成、极性、pH值来达到改变k的目 的 8流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪几种? 解流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处,气泡进入检测器,引起光吸收成电信 号的变化,基线突然跳动,干扰检测;溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时,可能与流动相或 固定相发生化学反应;溶解气体还会引起某些样品的氧化降解.对分离和分析结果带来误差。 因此,使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种:(1)加热脱气法:(2)抽吸脱气 法:(3)吹氦脱气法:(4)超声波振荡脱气法 9按固定相孔径大小分类,液相色谱固定相有哪几类?各有 什么特性及适用范围? 解从固定相的孔隙深度考虑,液相色谱固定相分为表面多孔型薄壳型)和全多孔型(全 孔型)两类 表面多孔型固定相多孔层厚度小.孔浅,相对死体积小,出峰迅速,柱效高,颗粒较大 渗透性妤,由于孔浅,梯度淋洗时,当流动相成分改变后.孔内外流动相成分能迅速达到平 衡,机械强度高,装柱容易,其不足的是由于多孔层厚度小,因而柱容量小,最大允许样品 量受到限制,适用于比较简单的样品分析及快速分析。 全多孔型固定相,由于颗粒很细,孔仍然很浅.传质速度较快,柱效高。梯度淋洗时孔 内外流动相成分的平衡速度仍然较快.其最大特点是柱容量大,最大允许样品量是表面多孔 型的5倍,但装填的什于渗透性低,因而需要更高的操作压力.制柱比表面多孔型的难。这 种固定相特别有利于痕量组分及多组分复杂混合物的分离分析 10什么叫化学键合色谱?与液一液色谱相比有何优点? 解通过化学反应,将固定液键合到载体表面,此种固定相称为化学键合固定相:采用 化学键合固定相的色谱法,称为化学键合色谱。 与液一液分配色谱相比,键合色谱法的主要优点:(1)化学键合固定相非常稳定,在使 用过程中不流失。(2)适宜用梯度淋洗。(3)适合于k范围很宽的样品。(4)由于键合到载体表 面官能团,既可是非极性的,也可是极性的,因此应用面广。 11(选择题)在液相色谱中,常用作固定相合相基体的物质是 A.分子筛B.硅胶c氧化铝D.活性炭
不同? 解 梯度淋洗就是在分离过程中．让流动相的组成、极性、pH 值等按‘定程序连续变 化。使样品中各组分能在最佳的 k 下出峰。使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分，保 留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离，特别适合样品中组分的 k 值范围很宽的复杂 样品的分析。梯度淋洗十分类似气相色谱的程序升温，两者的目的相同。不同的是程序升温 是通过程序改变柱温。而液相色谱是通过改变流动相组成、极性、pH 值来达到改变 k 的目 的。 8 流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪几种? 解 流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处，气泡进入检测器，引起光吸收成电信 号的变化，基线突然跳动，干扰检测；溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或 固定相发生化学反应；溶解气体还会引起某些样品的氧化降解．对分离和分析结果带来误差。 因此，使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种：(1)加热脱气法；(2)抽吸脱气 法；(3)吹氦脱气法；(4)超声波振荡脱气法。 9 按固定相孔径大小分类，液相色谱固定相有哪几类?各有 什么特性及适用范围? 解 从固定相的孔隙深度考虑，液相色谱固定相分为表面多孔型(薄壳型)和全多孔型(全 孔型)两类。 表面多孔型固定相多孔层厚度小．孔浅，相对死体积小，出峰迅速，柱效高，颗粒较大， 渗透性好，由于孔浅，梯度淋洗时，当流动相成分改变后．孔内外流动相成分能迅速达到平 衡，机械强度高，装柱容易，其不足的是由于多孔层厚度小，因而柱容量小，最大允许样品 量受到限制，适用于比较简单的样品分析及快速分析。 全多孔型固定相，由于颗粒很细，孔仍然很浅．传质速度较快，柱效高。梯度淋洗时孔 内外流动相成分的平衡速度仍然较快．其最大特点是柱容量大，最大允许样品量是表面多孔 型的 5 倍，但装填的什于渗透性低，因而需要更高的操作压力．制柱比表面多孔型的难。这 种固定相特别有利于痕量组分及多组分复杂混合物的分离分析。 10 什么叫化学键合色谱? 与液—液色谱相比有何优点? 解 通过化学反应，将固定液键合到载体表面，此种固定相称为化学键合固定相；采用 化学键合固定相的色谱法，称为化学键合色谱。 与液—液分配色谱相比，键合色谱法的主要优点：(1)化学键合固定相非常稳定，在使 用过程中不流失。(2)适宜用梯度淋洗。(3)适合于 k 范围很宽的样品。(4)由于键合到载体表 面官能团，既可是非极性的，也可是极性的，因此应用面广。 11 (选择题)在液相色谱中，常用作固定相合相基体的物质是 A．分子筛 B．硅胶 c 氧化铝 D．活性炭
解B.硅胶 要形成化学键合固定相,所用的基质材料应有某种化学反应活性,在四种固体固定相 中只有硅胶合有硅醇基,是能进行键合的活性官能团 12高效液相色谱柱有哪几种类型?细径柱有什么优点? 解高效液相色谱拄大致可分为三种类型:内径小于2mm的称为细管径或微管径柱 内径在2~5mm范围内的是常规高效液相色谱柱;内径大于5mm的一般称为半制备柱或制 备柱。细管径柱的主要优点是:(1)分离效能高。(2)流动相最佳流速低,消耗量少。(3)可采 用多种检测器,便于联用( CLC MS, CLC-FTIR)。(4)采用细而短的毛细管柱可以提高分析速 度,实现快速分析。 13什么叫反相色谱?试从固定相、流动相、流出次序、流动 相极性的影响等几个方面比较正相和反相的区别。 解流动相的极性比固定相的极性强的色谱体系叫反相色谱。例如以十八烷基硅胶键合 相(ODS)为固定相,以甲酵水作流动相,是典型的反相色谱。正相色谱和反相色谱这两种操 作模式的主要区别见下表: 正相和反相色谱的区别 比较项目 正相色谱 反相色谱 固定相 极性 非(弱)极性 流动相 非(弱)极性 极性 流出次序 极性组分k大 极性组分k小 流动相极性的影响 极性增加,k减小 极性增加,k增大 14对液相色谱流动相有何要求? 解用作液相色谱流动相的溶剂,其纯度和化学特性必须满足色谱过程中稳定性和重复 性的要求。对样品要有一定的溶解能力,粘度小,化学稳定性好,避免发生不可逆的化学吸 附。溶剂应与检测器相匹配,不干涉所使用检测器的工作,制备色谱的溶剂应不干扰对分离 各组分的回收。除此以外,选择的溶剂对所给定的样品组分具有合适的极性和良好的选择性。 15在150×φ2mm硅胶柱流动相为已烷/甲醇(150:2),紫外 检测器色谱条件下分离丙烯酰胺,判断以下组分的出峰次序,为 什么?
解 B．硅胶。 要形成化学键合固定相，所用的基质材料应有某种化学反应活性，在四种固体固定相 中只有硅胶合有硅醇基，是能进行键合的活性官能团。 12 高效液相色谱柱有哪几种类型? 细径柱有什么优点? 解 高效液相色谱拄大致可分为三种类型：内径小于 2mm 的称为细管径或微管径柱； 内径在 2~5mm 范围内的是常规高效液相色谱柱；内径大于 5mm 的一般称为半制备柱或制 备柱。细管径柱的主要优点是：(1)分离效能高。(2)流动相最佳流速低，消耗量少。(3)可采 用多种检测器，便于联用(CLC MS，CLC-FTIR)。(4)采用细而短的毛细管柱可以提高分析速 度，实现快速分析。 13 什么叫反相色谱?试从固定相、流动相、流出次序、流动 相极性的影响等几个方面比较正相和反相的区别。 解 流动相的极性比固定相的极性强的色谱体系叫反相色谱。例如以十八烷基硅胶键合 相(ODS)为固定相，以甲酵/水作流动相，是典型的反相色谱。正相色谱和反相色谱这两种操 作模式的主要区别见下表： 正相和反相色谱的区别 比较项目 正相色谱 反相色谱 固定相 流动相 流出次序 流动相极性的影响 极性 非（弱）极性 极性组分 k 大 极性增加，k 减小 非（弱）极性 极性 极性组分 k 小 极性增加，k 增大 14 对液相色谱流动相有何要求? 解 用作液相色谱流动相的溶剂，其纯度和化学特性必须满足色谱过程中稳定性和重复 性的要求。对样品要有一定的溶解能力，粘度小，化学稳定性好，避免发生不可逆的化学吸 附。溶剂应与检测器相匹配，不干涉所使用检测器的工作，制备色谱的溶剂应不干扰对分离 各组分的回收。除此以外，选择的溶剂对所给定的样品组分具有合适的极性和良好的选择性。 15 在 150× 2mm 硅胶柱流动相为已烷／甲醇(150：2)，紫外 检测器色谱条件下分离丙烯酰胺，判断以下组分的出峰次序，为 什么?
A. CH2CH-C-NHH-CH2OH B CH2=CH -CNH 解在给定的色谱条件下,组分B先出峰,组分A后出峰。以硅胶为固定相,己烷/甲 醇(150:2)为流动相,该体系为正相色谱,样品的极性A>B,在正相色谱体系极性小的组 分先出峰,极性大的组分后出峰,所以出峰次序为B先出,A后出。 16在硅胶往上,用甲苯为流动相,某组分的保留时间为 3min,如果改用四氯化碳或乙醚为流动相,试指岀选用哪一种 溶剂能减少该组分的保留时间?为什么? 解该体系为正向色谱体系。在该体系中流动相的极性增大保留值减小。流动相甲苯 四氯化碳及乙醚的溶剂强度参数分别是029、0.18、0.38,因此选用溶剂强度参数大于甲苯 的乙醚,可缩短该化合物的保留时间 17在高效液相色谱中,组分和溶剂分子之间存在哪几种作 用力? 解存在色散力、偶极作用、氢键作用和介电作用等四种作用力。 18什么是溶剂极性参数与溶剂强度?它们之间的关系如何? 解溶剂分子与溶质分子以色散力、偶极作用力、氢键作用力及介电作用力四种方式进 行相互作用的能力称为分子的“极性”,溶剂的这种能力以溶剂极性参数P表示,P值越大, 溶剂的极性越强。 溶剂强度指用作流动相的溶剂,将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。 溶剂强度直接与溶剂的极性有关,而且随不同色谱体系而变,在正相色谱体系中,溶 剂极性增加,使组分从柱上洗脱下来的能力增加,即P越大的溶剂,溶剂强度越大。在反 相色谱中,溶剂极性减小,使组分从柱上洗脱下来的能力增加,即P'越小的溶剂,溶剂强 度越大。 19预测在正相色谱与反相色谱体系中,组分的出峰次序 解在正相色谱体系中组分的出峰次序为:极性弱的组分,在流动相中溶解度较大,因 此k值小,先出峰。极性强的组分,在固定相中的溶解度较大,因此k值大,后出峰。 在反相色谱中组分的出峰次序为:极性弱的组分在固定相上的溶解度大,k值大,后出 峰,相反极性强的组分在流动相中溶解度大,k值小,所以先出峰
解 在给定的色谱条件下，组分 B 先出峰，组分 A 后出峰。以硅胶为固定相，己烷/甲 醇(150：2)为流动相，该体系为正相色谱，样品的极性 A＞B，在正相色谱体系极性小的组 分先出峰，极性大的组分后出峰，所以出峰次序为 B 先出，A 后出。 16 在硅胶往上，用甲苯为流动相，某组分的保留时间为 30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流动相，试指出选用哪一种 溶剂能减少该组分的保留时间? 为什么? 解 该体系为正向色谱体系。在该体系中流动相的极性增大保留值减小。流动相甲苯、 四氯化碳及乙醚的溶剂强度参数分别是 0.29、0.18、0.38，因此选用溶剂强度参数大于甲苯 的乙醚，可缩短该化合物的保留时间。 17 在高效液相色谱中，组分和溶剂分子之间存在哪几种作 用力? 解 存在色散力、偶极作用、氢键作用和介电作用等四种作用力。 18 什么是溶剂极性参数与溶剂强度? 它们之间的关系如何? 解 溶剂分子与溶质分子以色散力、偶极作用力、氢键作用力及介电作用力四种方式进 行相互作用的能力称为分子的“极性”，溶剂的这种能力以溶剂极性参数 P’表示，P’值越大， 溶剂的极性越强。 溶剂强度指用作流动相的溶剂，将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。 溶剂强度直接与溶剂的极性有关，而且随不同色谱体系而变，在正相色谱体系中，溶 剂极性增加，使组分从柱上洗脱下来的能力增加，即 P’越大的溶剂，溶剂强度越大。在反 相色谱中，溶剂极性减小，使组分从柱上洗脱下来的能力增加，即 P’越小的溶剂，溶剂强 度越大。 19 预测在正相色谱与反相色谱体系中，组分的出峰次序。 解 在正相色谱体系中组分的出峰次序为：极性弱的组分，在流动相中溶解度较大，因 此 k 值小，先出峰。极性强的组分，在固定相中的溶解度较大，因此 k 值大，后出峰。 在反相色谱中组分的出峰次序为：极性弱的组分在固定相上的溶解度大，k 值大，后出 峰，相反极性强的组分在流动相中溶解度大，k 值小，所以先出峰