药学学报：《药物化学》教学资源（阅读资料）塞来昔布和COX-2选择性抑制剂

1010 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica206,51(6):1010-1016 新药发现与研究实例简析 新药创制是复杂的智力活动,涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效罘等多维科技活动。每个药物 都有自身的研发轨迹,而构建化学结构是最重要的环节,因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。 本栏目以药物化学视角,对有代表性的药物的成功构建,加以剖析和解读 前列腺素生理功能的阐明有助于理解非甾体抗美药物( NSAIDS)的作用机制和不良反应,环氧合酶2 (COⅩ2)的发现又为创制新型抗爽药提供了靶标,塞来昔布等昔布类药物的诞生受惠于生物学基础研究的成果。 其实,无论是传统的 NSAIDs还是昔布类药物都是COⅩ2和COX1双靶标抑制剂,只是抑制的相对程度不同罢 了。人们对COⅩ2病理和生理功能的认识经历了一个过程,新药研发中也为此付出了代价,罗非昔布和伐地考 昔的上市与撤市,折射出这个过程。 (编者按) DO:10.16438/0513-4870.20141060 塞来昔布和COX-2选择性抑制剂 郭宗儒 (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,北京100050) 1非甾体抗炎药和前列腺素 故。吲哚美辛对不同组织来源的COX抑制作用强度 1897年德国人 Hoffmann发明了阿司匹林,20世不同,预示COX有同工酶的存在( Flower Rj.The 纪50年代后出现的数10个非甾体抗炎药( NSAIDS) development of COX2 inhibitors. Nature Rev drug 作为解热、止痛和抗炎药物被广泛应用,同时发现它 Discov,2003,2:179-191) 们普遍存在不良反应,如胃肠道损伤和抑制血小板2环氧合酶2的发现 功能和凝血作用等。 NSAIDS的抗炎主作用与伴随的 1991年Xie等发现了一个新的mRNA编码蛋白, 那些不良反应,是与后来发现的前列腺素相关联的。与已知的COX序列相似但并不相同( Xie WL, 20世纪60年代末广泛研究前列腺素的功能,证 Chipman JG, Robertson dl,eta. Expression of a mi- 明血小板聚集产生前列腺素,引起发热和炎症;在胃 togen-responsive gene encoding prostaglandin synthase 黏膜中检测出前列腺素,证明可保护胃黏膜免于溃 Is regulated by mRNA splicing. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:2692-2696)。同年 Kujubu等发现了新 疡发生。前列腺素具有多种生理功能,功过参半 的cDNA编码蛋白,其序列也与COx相似( Kujubu 1971年Vane发现环氧合酶(COX)催化花生四 DA, Fletcher BS, Varnum BC, et al. TIS10, a phorbol 烯酸(AA)转变成前列腺素 NSAIDS抑制COX酶活 ester tumor promoter inducible mRNA from Swiss3T3 性,阻止前列腺素的生成,从而将上述 NSAIDs的抗cel, encodes a novel prostaglandin synthase/cyclooxy 炎作用和不良反应归结为COX被抑制所致。后来还 genase homologue. j Biol Chem,1991,266:12866 证明所有的 NSAIDS在治疗剂量下血浆药物浓度都12872)后来证明xe与 Kujulu等发现的蛋白是同 可抑制COX活性,为离体筛选化合物抑制COX酶和种酶,该酶在炎症细胞中高表达,是炎症细胞被诱导 抗炎活性打下了生物学基础。 产生的,并将新发现的酶称作环氧合酶2(COX2),已 然而,一些例外的现象促使人们设想COX可能知的酶称作COX1。 有多种亚型,以致不同的药物的选择性不同。例如也 发现了COX2和COX1是同工酶,并分别将这两 属于 NSAIDS的p-乙酰氨基酚只有解热而无抗炎作种酶的功能与 NSAIDS的抗炎作用与不良反应关联 用,推论是只抑制脑内COX而不抑制外周COX的缘在一起:COX2是炎症细胞诱导产生的“坏”酶,是

· 1010 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (6): 1010 −1016 ·新药发现与研究实例简析· 新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物 都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。 本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。 前列腺素生理功能的阐明有助于理解非甾体抗炎药物 (NSAIDs) 的作用机制和不良反应, 环氧合酶 2 (COX2) 的发现又为创制新型抗炎药提供了靶标, 塞来昔布等昔布类药物的诞生受惠于生物学基础研究的成果。 其实, 无论是传统的 NSAIDs 还是昔布类药物都是 COX2 和 COX1 双靶标抑制剂, 只是抑制的相对程度不同罢 了。人们对 COX2 病理和生理功能的认识经历了一个过程, 新药研发中也为此付出了代价, 罗非昔布和伐地考 昔的上市与撤市, 折射出这个过程。 ( 编者按) DOI: 10.16438/j.0513-4870.2014-1060 塞来昔布和 COX-2 选择性抑制剂 郭宗儒 (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050) 1 非甾体抗炎药和前列腺素 1897 年德国人 Hoffmann 发明了阿司匹林, 20 世 纪 50 年代后出现的数 10 个非甾体抗炎药 (NSAIDs) 作为解热、止痛和抗炎药物被广泛应用, 同时发现它 们普遍存在不良反应, 如胃肠道损伤和抑制血小板 功能和凝血作用等。NSAIDs 的抗炎主作用与伴随的 那些不良反应, 是与后来发现的前列腺素相关联的。 20 世纪 60 年代末广泛研究前列腺素的功能, 证 明血小板聚集产生前列腺素, 引起发热和炎症; 在胃 黏膜中检测出前列腺素, 证明可保护胃黏膜免于溃 疡发生。前列腺素具有多种生理功能, 功过参半。 1971 年 Vane 发现环氧合酶 (COX) 催化花生四 烯酸 (AA) 转变成前列腺素, NSAIDs 抑制 COX 酶活 性, 阻止前列腺素的生成, 从而将上述 NSAIDs 的抗 炎作用和不良反应归结为 COX 被抑制所致。后来还 证明所有的 NSAIDs 在治疗剂量下血浆药物浓度都 可抑制 COX 活性, 为离体筛选化合物抑制 COX 酶和 抗炎活性打下了生物学基础。 然而, 一些例外的现象促使人们设想 COX 可能 有多种亚型, 以致不同的药物的选择性不同。例如也 属于 NSAIDs 的 p-乙酰氨基酚只有解热而无抗炎作 用, 推论是只抑制脑内 COX 而不抑制外周 COX 的缘 故。吲哚美辛对不同组织来源的 COX 抑制作用强度 不同, 预示 COX 有同工酶的存在 (Flower RJ. The development of COX2 inhibitors. Nature Rev Drug Discov, 2003, 2: 179−191)。 2 环氧合酶 2 的发现 1991 年 Xie 等发现了一个新的 mRNA 编码蛋白, 与已知的 COX 序列相似但并不相同 (Xie WL, Chipman JG, Robertson DL, et al. Expression of a mi￾togen-responsive gene encoding prostaglandin synthase is regulated by mRNA splicing. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 2692−2696)。同年 Kujubu 等发现了新 的 cDNA 编码蛋白, 其序列也与 COX 相似 (Kujubu DA, Fletcher BS, Varnum BC, et al. TIS10, a phorbol ester tumor promoter inducible mRNA from Swiss 3T3 cells, encodes a novel prostaglandin synthase/cyclooxy￾genase homologue. J Biol Chem, 1991, 266: 12866 − 12872), 后来证明 Xie 与 Kujulu 等发现的蛋白是同一 种酶, 该酶在炎症细胞中高表达, 是炎症细胞被诱导 产生的, 并将新发现的酶称作环氧合酶 2 (COX2), 已 知的酶称作 COX1。 发现了 COX2 和 COX1 是同工酶, 并分别将这两 种酶的功能与 NSAIDs 的抗炎作用与不良反应关联 在一起: COX2 是炎症细胞诱导产生的“坏”酶, 是

郭宗儒:塞来昔布和COX-2选择性抑制剂 1011 NSAIDS抗炎作用的靶标;COX1是正常细胞所固有 的“好”酶, NSAIDS的不良反应是抑制COX1所致 对COX2的脱靶作用( off-target)导致血小板的抑制 和消化道损伤。这样简明的对COX和COX2功能 的判断无疑对新药研究产生了巨大的吸引力,认为 Br 只要找到选择性抑制COX2的化合物,就应是没有不 良反应的理想抗炎药。制药界对COX2的发现抱有极 大的热情和希望。然而,药物化学家却因这两种酶活 性中心的氨基酸序列极其相似,未能解析酶的三维 结构,以致理性设计选择性COX2抑制剂无从着手 3表型筛选一先导化合物的发现 1990年杜邦公司在研发抗炎药物中发现化合物 低2个数量级。 1(DP697)对实验动物有强效抗炎作用,而且引起42环戊烯的4位取代在环戊烯的4位进行双甲 消化道溃疡作用很弱。体外实验表明化合物1对大鼠 基取代,提高了对COⅹ1的抑制活性,选择性下降, 而4,4-二乙基为母核的抑制COX2活性显著降低。说 脑中前列腺素的合成有显著抑制活性(是抑制了 CoX2的缘故,而对来源于大鼠肾组织的环氧合酶4位烷基取代对COx2的选择性抑制作用是不利 (主要为COX1)活性较弱。这些结果提示化合物1有 的。化合物2体内具有强效抗炎作用,大鼠关节炎佐 别于传统的 NSAIDS( Gans Kr, Galbraith w, Roman 剂模型灌胃的抗炎活性ED0=1.7mgkg-,小鼠灌胃 J,eta. Anti-inflammatory and safety profile of DuP600mgkg-或大鼠灌胃200mgkg1都未引起胃肠道 697, a novel orally effective prostaglandin synthesis 的损伤。体内外实验都表明化合物2是选择性COX2 inhibitor. J Pharmacol Exp Ther, 1990, 254: 180-187) 抑制剂( Reitz dB,LiJ, Norton MB,etal. Selective 化合物1对COx2抑制活性K=03mlL-,抑 clooxygenase inhibitors: novel I2 - diarylcyclopen 制COX1的K值为53μmolL,表现出对COx2的 tenes are potent and orally active COX-2 inhibitors. J Med Chem,1994,37:3878-3881)。 选择性抑制( Magolda rl, Batt D, Covington mB,et 4.3A环4氨磺酰基与4-甲磺酰基的比较为了优 al. Structure-activity-relationships with a novel series of selective cyclooxygenase-2 inhibitors. Inflamm Res 化环戊烯系列的抗炎活性,通式为4的R1=H2NSO 1995,44(supp.3)A274)。佐剂诱导的大鼠关节炎模 R2=F的化合物,对COX2的抑制活性比化合物2提 型经灌胃给予化合物1,ED50=018mgkg,而400高了近3倍(C0=0.007 umol. L),但对COX1的抑 mgkg灌胃,未出现消化道损伤,提示该化合物是制活性提高更多(Cs0=42 umol-L),导致选择性降 COX2选择性抑制剂 低为600倍( Reitz De,LiJJ, Norton MB,etal 2-Diarylcyclopentenes are selective potent and orally Seale公司(当时隶属孟山多)从化合物2( -- active cyclooxygenase inhibitors. Med Chem Re199 5760)和3(SC-58125)出发,即以环戊烯和吡唑环5:351-363),同样R1=HNSO2R2为Cl、CF3、(CH)2N 连接含有甲磺酰基的苯环为模板,研发选择性CO等取代基时,对COX2的抑制作用也强于R1=H3CSO2 2抑制剂。化合物1~3结构的共同特征(即药效团)的相应化合物,而且对COX1的抑制也相对提高,选 是两个芳环处于双键的顺式(吡唑环也具有平面性)择性作用普遍下降数10倍,提示氨磺酰基抑制COx2 在一个芳环上有甲磺酰基取代,连接苯环的中间环活性强于相应的甲磺酰基,但选择性 可以变换 HNSO2,B环为3,4,5-三取代时,选择性强于3,4"- 4以环戊烯为连接基的化合物系列 二取代,后者的选择性又强于4-单取代,提示B环存 4.1B环取代基的变换化合物2(4-F)对COX2在多取代基,体积加大有利于提升对COX2选择性作 抑制活性的IC0=0.026pmoL,Cox1的ICs>100用。 umol-L,对COX2的选择性>3800,4Cl或4CH3 化合物5对COX2的ICs0=0002molL,是体 的活性和选择性与2相似,但4OCH3的选择性下降,外活性最强的化合物,对COX1的IC30=3.8molL, 虽然对COX2的活性未明显改变。4-CN、4-CH2OH选择性高达1900倍,但灌胃给药体内的抗炎作用很 和4CH2OCH3以及4位无取代基的COX2活性均降弱,是由于甲氧基迅速被代谢的缘故。不利的药代削

郭宗儒: 塞来昔布和 COX-2 选择性抑制剂 · 1011 · NSAIDs 抗炎作用的靶标; COX1 是正常细胞所固有 的“好”酶, NSAIDs 的不良反应是抑制 COX1 所致, 对 COX2 的脱靶作用 (off-target) 导致血小板的抑制 和消化道损伤。这样简明的对 COX1 和 COX2 功能 的判断无疑对新药研究产生了巨大的吸引力, 认为 只要找到选择性抑制 COX2 的化合物, 就应是没有不 良反应的理想抗炎药。制药界对 COX2 的发现抱有极 大的热情和希望。然而, 药物化学家却因这两种酶活 性中心的氨基酸序列极其相似, 未能解析酶的三维 结构, 以致理性设计选择性 COX2 抑制剂无从着手。 3 表型筛选—先导化合物的发现 1990 年杜邦公司在研发抗炎药物中发现化合物 1 (DuP-697) 对实验动物有强效抗炎作用, 而且引起 消化道溃疡作用很弱。体外实验表明化合物 1 对大鼠 脑中前列腺素的合成有显著抑制活性 (是抑制了 COX2 的缘故), 而对来源于大鼠肾组织的环氧合酶 (主要为 COX1) 活性较弱。这些结果提示化合物 1 有 别于传统的 NSAIDs。(Gans KR, Galbraith W, Roman RJ, et al. Anti-inflammatory and safety profile of DuP 697, a novel orally effective prostaglandin synthesis inhibitor. J Pharmacol Exp Ther, 1990, 254: 180 −187)。 化合物 1 对 COX2 抑制活性 Ki=0.3 μmol·L −1 , 抑 制 COX1 的 Ki 值为 5.3 μmol·L −1 , 表现出对 COX2 的 选择性抑制 (Magolda RL, Batt D, Covington MB, et al. Structure-activity-relationships with a novel series of selective cyclooxygenase-2 inhibitors. Inflamm Res, 1995, 44 (suppl.3): A274)。佐剂诱导的大鼠关节炎模 型经灌胃给予化合物 1, ED50 = 0.18 mg·kg−1 , 而 400 mg·kg−1 灌胃, 未出现消化道损伤, 提示该化合物是 COX2 选择性抑制剂。 Seale 公司 (当时隶属孟山多) 从化合物 2 (SC- 57666) 和 3 (SC-58125) 出发, 即以环戊烯和吡唑环 连接含有甲磺酰基的苯环为模板, 研发选择性 COX 2 抑制剂。化合物 1～3 结构的共同特征 (即药效团) 是两个芳环处于双键的顺式 (吡唑环也具有平面性), 在一个芳环上有甲磺酰基取代, 连接苯环的中间环 可以变换。 4 以环戊烯为连接基的化合物系列 4.1 B 环取代基的变换 化合物 2 (4'-F) 对 COX2 抑制活性的 IC50=0.026 μmol·L −1 , COX1 的 IC50>100 μmol·L −1 , 对 COX2 的选择性>3800, 4'-Cl 或 4'-CH3 的活性和选择性与 2 相似, 但 4'-OCH3的选择性下降, 虽然对 COX2 的活性未明显改变。4'-CN、4'-CH2OH 和 4'-CH2OCH3 以及 4'位无取代基的 COX2 活性均降 低 2 个数量级。 4.2 环戊烯的 4 位取代 在环戊烯的 4 位进行双甲 基取代, 提高了对 COX1 的抑制活性, 选择性下降, 而 4,4-二乙基为母核的抑制 COX2 活性显著降低。说 明 4 位烷基取代对 COX2 的选择性抑制作用是不利 的。化合物 2 体内具有强效抗炎作用, 大鼠关节炎佐 剂模型灌胃的抗炎活性 ED50=1.7 mg·kg−1 , 小鼠灌胃 600 mg·kg−1 或大鼠灌胃 200 mg·kg−1 都未引起胃肠道 的损伤。体内外实验都表明化合物 2 是选择性 COX2 抑制剂 (Reitz DB, Li JJ, Norton MB, et al. Selective cyclooxygenase inhibitors: novel 1,2-diarylcyclopen￾tenes are potent and orally active COX-2 inhibitors. J Med Chem, 1994, 37: 3878−3881)。 4.3 A 环 4-氨磺酰基与 4-甲磺酰基的比较 为了优 化环戊烯系列的抗炎活性, 通式为 4 的 R1 = H2NSO2, R2 = F 的化合物, 对 COX2 的抑制活性比化合物 2 提 高了近 3 倍 (IC50=0.007 μmol·L −1 ), 但对 COX1 的抑 制活性提高更多 (IC50=4.2 μmol·L −1 ), 导致选择性降 低为 600 倍 (Reitz DB, Li JJ, Norton MB, et al. 2-Diarylcyclopentenes are selective potent and orally active cyclooxygenase inhibitors. Med Chem Res, 1995, 5: 351−363), 同样 R1=H2NSO2, R2为 Cl、CF3、(CH3)2N 等取代基时, 对 COX2 的抑制作用也强于 R1=H3CSO2 的相应化合物, 而且对 COX1 的抑制也相对提高, 选 择性作用普遍下降数 10 倍, 提示氨磺酰基抑制 COX2 活性强于相应的甲磺酰基, 但选择性降低。当 R1 = H2NSO2, B 环为 3',4',5'-三取代时, 选择性强于 3',4'- 二取代, 后者的选择性又强于 4'-单取代, 提示 B 环存 在多取代基, 体积加大有利于提升对 COX2 选择性作 用。 化合物 5 对 COX2 的 IC50=0.002 μmol·L −1 , 是体 外活性最强的化合物, 对COX1的IC50=3.8 μmol·L −1 , 选择性高达 1 900 倍, 但灌胃给药体内的抗炎作用很 弱, 是由于甲氧基迅速被代谢的缘故。不利的药代削

1012 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2016,51(6:1010-1016 弱了药效。 化合物6对COX2和COX1的IC5o分别为001 和51 umol. L,选择性为500虽然是代谢稳定的化 合物,高剂量不诱发消化道损伤,但抗炎作用弱于 NSAID吲哚美辛。 甲基或二氟甲基,通式7的R作广泛的变换,以改变 化合物的物理性质如溶解度、logP、pka、离解性等, 探索对COX2的抑制强度和选择性。构效关系如下 ①2-和4-位单取代的活性强度高于相应的3位取代; ②吸电子基团降低COX2抑制活性,对COX1没有 H2 活性;推电子基团同时提高对COX2和COX1的抑制 活性。引入两个推电子基团更降低抑制COⅩ1的作用, 保持对COX2的高活性;③R=卤素、甲基和甲氧基可 保持COX2的高抑制活性,降低COX1的作用;④4 4.4磺酰基的变换用其他功能基替换甲磺酰基或乙基活性低于4-甲基;4-乙氧基也低于4-甲氧基,推」 氨磺酰基,以确定对活性或选择性影响,图1列出了论4-位基团体积不宜大 λ环上用三氟甲磺酰基、甲磺酰亚氨基、乙酰基、羧5.2吡唑环3位取代基的变换吡唑环3位取代基 基、甲膦酸基以及磷酸基等取代,B环为4氟苯基的以CF3或CHF2为优势取代,甲基、氰基等对活性是 化合物,抑制COX2活性减弱到ICs0>0.1 umol.L,不利的。 所以,甲(或氨)磺酰基应是优化的药效团。(LiJ 5.3氨磺酰基的变换与环戊烯系列相似,A环为氨 Anderson GD, Burton EG, et al. 1, 2-Diarylcyclopentenes 磺酰基的COX2活性强于甲磺酰基,但选择性低于甲 as selective cyclooxygenase-2 inhibitors and orally active 磺酰基。氨基上氢原子(一个或两个)被甲基取代丧 anti-inflammatory agents. J Med Chem, 1995, 38 失活性,或换作甲磺酰氨基、硝基、三氟乙酰基都会 4570-4578)。 失去活性。没有磺酰基的二苯基吡唑化合物,失去 COX2的活性,却保持有抑制COX1的作用 5.4苯环B用其他环替换用吡啶、噻吩、呋喃、 苯并呋喃或苯并噻吩替换苯环B,对提高活性或选择 性没有明显作用。 6候选化合物的选择 61在体内长久存留的化合物不宜遴选在上述优 H3C 化和探索构效关系的操作中,化合物8(SC-236)体 外抑制COX2活性C50=001 umol.L,对COX1活 性ICs0=178molL,选择性1780倍。体内灌胃对 图1甲(或氨)磺酰基被其他功能基置换失去抑制COX2活性大鼠关节炎佐剂的抗炎作用ED0=0.07mgkg,对 角叉菜胶引起大鼠后趾肿胀的抗炎作用EDso=54 5吡唑环系的结构优化 mgkg,大鼠痛觉减退的EDo=66mgkg-,呈现出 在上述优化环戊烯化合物2的同时,连接两个苯体内外的高活性和选择性,拟确定为候选化合物。然 环的吡唑环化合物3也作为先导化合物进行了优化,而大鼠药代动力学表明,灌胃吸收后在血浆的半衰 采用传统药物化学方法,分析构效关系以优化活性期tna=117h,这样长时间在体内的存留,会造成药 和选择性。借鉴上述的氨磺酰苯基化合物具有较高抑物蓄积而引起不良反应,故未选为候选化合物。 制COX2活性,将吡唑环系的A环固定为氨磺酰基苯6.2调整药代—含有代谢位点的候选化合物:塞来 基,即通式为7的化合物,变换B环的取代基团 昔布的确定在高活性的化合物中选择可在体内发 51苯环B的取代基变换固定吡唑环3位的三氟生代谢转化,以便有适宜的药代动力学性质,例如含

· 1012 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (6): 1010 −1016 弱了药效。 化合物 6 对 COX2 和 COX1 的 IC50 分别为 0.01 和 5.1 μmol·L −1 , 选择性为 500, 虽然是代谢稳定的化 合物, 高剂量不诱发消化道损伤, 但抗炎作用弱于 NSAID 吲哚美辛。 4.4 磺酰基的变换 用其他功能基替换甲磺酰基或 氨磺酰基, 以确定对活性或选择性影响, 图 1 列出了 A 环上用三氟甲磺酰基、甲磺酰亚氨基、乙酰基、羧 基、甲膦酸基以及磷酸基等取代, B 环为 4-氟苯基的 化合物, 抑制 COX2 活性减弱到 IC50 > 0.1 μmol·L −1 , 所以, 甲 (或氨) 磺酰基应是优化的药效团。(Li JJ, Anderson GD, Burton EG, et al. 1,2-Diarylcyclopentenes as selective cyclooxygenase-2 inhibitors and orally active anti-inflammatory agents. J Med Chem, 1995, 38: 4570−4578)。 图 1 甲 (或氨) 磺酰基被其他功能基置换失去抑制 COX2活性 5 吡唑环系的结构优化 在上述优化环戊烯化合物 2 的同时, 连接两个苯 环的吡唑环化合物 3 也作为先导化合物进行了优化, 采用传统药物化学方法, 分析构效关系以优化活性 和选择性。借鉴上述的氨磺酰苯基化合物具有较高抑 制 COX2 活性, 将吡唑环系的 A环固定为氨磺酰基苯 基, 即通式为 7 的化合物, 变换 B 环的取代基团。 5.1 苯环 B 的取代基变换 固定吡唑环 3 位的三氟 甲基或二氟甲基, 通式 7 的 R 作广泛的变换, 以改变 化合物的物理性质如溶解度、log P、pKa、离解性等, 探索对 COX2 的抑制强度和选择性。构效关系如下: ① 2'-和 4'-位单取代的活性强度高于相应的 3'位取代; ② 吸电子基团降低 COX2 抑制活性, 对 COX1 没有 活性; 推电子基团同时提高对 COX2 和 COX1 的抑制 活性。引入两个推电子基团更降低抑制 COX1 的作用, 保持对 COX2 的高活性; ③ R=卤素、甲基和甲氧基可 保持 COX2 的高抑制活性, 降低 COX1 的作用; ④ 4'- 乙基活性低于 4'-甲基; 4'-乙氧基也低于 4'-甲氧基, 推 论 4'-位基团体积不宜大。 5.2 吡唑环 3 位取代基的变换 吡唑环 3 位取代基 以 CF3 或 CHF2 为优势取代, 甲基、氰基等对活性是 不利的。 5.3 氨磺酰基的变换 与环戊烯系列相似, A环为氨 磺酰基的 COX2 活性强于甲磺酰基, 但选择性低于甲 磺酰基。氨基上氢原子 (一个或两个) 被甲基取代丧 失活性, 或换作甲磺酰氨基、硝基、三氟乙酰基都会 失去活性。没有磺酰基的二苯基吡唑化合物, 失去 COX2 的活性, 却保持有抑制 COX1 的作用。 5.4 苯环 B 用其他环替换 用吡啶、噻吩、呋喃、 苯并呋喃或苯并噻吩替换苯环 B, 对提高活性或选择 性没有明显作用。 6 候选化合物的选择 6.1 在体内长久存留的化合物不宜遴选 在上述优 化和探索构效关系的操作中, 化合物 8 (SC-236) 体 外抑制 COX2 活性 IC50 = 0.01 μmol·L −1 ; 对 COX1 活 性 IC50=17.8 μmol·L −1 , 选择性 1 780 倍。体内灌胃对 大鼠关节炎佐剂的抗炎作用 ED50 = 0.07 mg·kg−1 , 对 角叉菜胶引起大鼠后趾肿胀的抗炎作用 ED50 = 5.4 mg·kg−1 , 大鼠痛觉减退的 ED50=6.6 mg·kg−1 , 呈现出 体内外的高活性和选择性, 拟确定为候选化合物。然 而大鼠药代动力学表明, 灌胃吸收后在血浆的半衰 期 t1/2 = 117 h, 这样长时间在体内的存留, 会造成药 物蓄积而引起不良反应, 故未选为候选化合物。 6.2 调整药代—含有代谢位点的候选化合物: 塞来 昔布的确定 在高活性的化合物中选择可在体内发 生代谢转化, 以便有适宜的药代动力学性质, 例如含

郭宗儒:塞来昔布和COX-2选择性抑制剂 有甲基或甲氧基等基团的化合物,在体内可发生氧择性差异。COX2与COX1酶活性中心的重要区别是 化代谢,为此选择了9、10和11等化合物进行了体①COX2的残基val523对应在COX1是le523,缬 内药效和药代实验。表1列出了它们的生物学数据。氨酸的侧链比异亮氨酸少1个碳原子,占据较小的空 ( Penning tD, Talley J., Bertenshaw SR,etal. Synthesis间,因而COX2的结合腔可利用空间大于COX1的 and biological evaluation of the 1- diarylpyrazole class②COx2的残基Leu503对应在COX1是Phe503,苯 of cyclooxygenase-2 inhibitors: identification of45丙氨酸的侧链体积大于亮氨酸(图2中未标出)又 (4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1 H-pyrazol-l-yll 为选择性COX2抑制剂腾出可占据的空间。这样使 benzenesulfonamide (SC-58635, celecoxib Chem,1997,40:1347-1365) 得COX2活性部位的容积比COX1大约多出25%,设 综合多项活性数据,化合物11优于其他化合物, 计COX2抑制剂就是利用了这个结构差异。③COX2 确定为候选药物作进一步研发,定名为塞来昔布的残基Arg513对应在COx1是Hs13,精氨酸残基 ( celecoxib)。I期临床试验表明塞来昔布的半衰期为 可与氨磺酰基形成氢键,并与Tyr355和val523形成 12h,口服tmx为2h,体内代谢产物主要是4-甲基了一个可与苯磺酰氨片段结合的结合腔( Kurumbail 经P450催化氧化生成羟甲基和羧基进而葡醛酸苷化 等化合物。经I、Ⅲ期临床研究,FDA于1999年批 准上市,治疗骨关节炎和风湿性关节炎。 7选择性COX2抑制剂的结构基础 塞来昔布的研制,苗头和先导化合物是经动物 表型/功能实验确定的,先导物优化是用体外酶法评 价对COX2/COX1的活性,当时尚未解析出酶的三维 结构,因而是靠药物化学方法和构效关系分析进行 的。1996年解析了COX2与选择性抑制剂12(SC-558 与塞来昔布的结构只是4-溴与甲基之别)复合物的 晶体结构,并用氟比洛芬和吲哚美辛的复合物作比 较,得以解释COX2选择性抑制剂的结构特征 COX1与COX2作为同工酶,虽然都是以花生四 烯酸为底物,而且活性中心的氨基酸序列大同小异 但在活性中心的关键性氨基酸残基有区别,导致选图2化合物1与COX2复合物的晶体结构(也标出了COx1 择性COX2抑制剂与传统 NSAIDS对两种酶结合的选相应的氨基酸残基) CH3 H2N" OCH3 H2N 表1有代表性化合物的体内外抗炎活性和大鼠血浆中半衰期 COX2 ICs/umol.L COXI ICso/umol.L 大鼠佐剂性关节炎模型 EDs/mg 0.37 大鼠角叉菜胶模型 EDso/mg.kg 大鼠痛觉减退 EDso/mg kg 大鼠血浆半衰期/h 117(灌胃) 33(灌胃) 3.5(静注) 3.5(静注) 大鼠灌胃200mgkg-引起胃损伤

郭宗儒: 塞来昔布和 COX-2 选择性抑制剂 · 1013 · 有甲基或甲氧基等基团的化合物, 在体内可发生氧 化代谢, 为此选择了 9、10 和 11 等化合物进行了体 内药效和药代实验。表 1 列出了它们的生物学数据。 (Penning TD, Talley JJ, Bertenshaw SR, et al. Synthesis and biological evaluation of the 1,5-diarylpyrazole class of cyclooxygenase-2 inhibitors: identification of 4-[5- (4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1 H-pyrazol-1-yl] benzenesulfonamide (SC-58635, celecoxib). J Med Chem, 1997, 40: 1347−1365)。 综合多项活性数据, 化合物 11 优于其他化合物, 确定为候选药物作进一步研发, 定名为塞来昔布 (celecoxib)。I 期临床试验表明塞来昔布的半衰期为 12 h, 口服 tmax 为 2 h, 体内代谢产物主要是 4'-甲基 经 P450 催化氧化生成羟甲基和羧基进而葡醛酸苷化 等化合物。经 II、III 期临床研究, FDA 于 1999 年批 准上市, 治疗骨关节炎和风湿性关节炎。 7 选择性 COX2 抑制剂的结构基础 塞来昔布的研制, 苗头和先导化合物是经动物 表型/功能实验确定的, 先导物优化是用体外酶法评 价对 COX2/COX1 的活性, 当时尚未解析出酶的三维 结构, 因而是靠药物化学方法和构效关系分析进行 的。1996 年解析了 COX2 与选择性抑制剂 12 (SC-558, 与塞来昔布的结构只是 4'-溴与甲基之别) 复合物的 晶体结构, 并用氟比洛芬和吲哚美辛的复合物作比 较, 得以解释 COX2 选择性抑制剂的结构特征。 COX1 与 COX2 作为同工酶, 虽然都是以花生四 烯酸为底物, 而且活性中心的氨基酸序列大同小异, 但在活性中心的关键性氨基酸残基有区别, 导致选 择性 COX2 抑制剂与传统 NSAIDs 对两种酶结合的选 择性差异。COX2 与 COX1 酶活性中心的重要区别是: ① COX2 的残基 Val523 对应在 COX1 是 Ile523, 缬 氨酸的侧链比异亮氨酸少 1 个碳原子, 占据较小的空 间, 因而 COX2 的结合腔可利用空间大于 COX1 的。 ② COX2 的残基 Leu503 对应在 COX1 是 Phe503, 苯 丙氨酸的侧链体积大于亮氨酸 (图 2 中未标出), 又 为选择性 COX2 抑制剂腾出可占据的空间。这样使 得 COX2 活性部位的容积比 COX1 大约多出 25%, 设 计 COX2 抑制剂就是利用了这个结构差异。③ COX2 的残基 Arg513 对应在 COX1 是 His513, 精氨酸残基 可与氨磺酰基形成氢键, 并与 Tyr355 和 Val523 形成 了一个可与苯磺酰氨片段结合的结合腔 (Kurumbail 图 2 化合物 12 与 COX2复合物的晶体结构 (也标出了 COX1 相应的氨基酸残基) 表 1 有代表性化合物的体内外抗炎活性和大鼠血浆中半衰期 8 9 10 11 COX2 IC50/μmol·L −1 0.01 0.013 0.05 0.04 COX1 IC50/μmol·L −1 17.8 12.5 36.0 15.0 大鼠佐剂性关节炎模型 ED50/mg·kg−1 0.07 0.35 0.05 0.37 大鼠角叉菜胶模型 ED50/mg·kg−1 5.4 2.4 18.6 7.1 大鼠痛觉减退 ED50/mg·kg−1 6.6 37.3 33.0 34.5 大鼠血浆半衰期/h 117 (灌胃) 3.3 (灌胃) 3.5 (静注) 3.5 (静注) 大鼠灌胃 200 mg·kg−1 引起胃损伤 未见 未见 未见 未见

1014 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica206,51(6):1010-1016 RG. Stevens AM. Gierse JK et al. Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti- inflammatory agents, Nature, 1996, 384: 644-648) 8罗非昔布的命运 8.1追求高活性和高选择性抑制剂默克公司以化 合物1为模板,固定甲磺酰苯基和4-氟代苯片段,变表2化合物14与塞来昔布、美洛昔康和二氯酚酸对COX2 换中间的五元环连接基,如图3所示的杂环母核。用和COX1的抑制活性。全血来源的COX酶。不同来源的酶对 重组人COX2和COX1酶评价化合物的体外活性,以抑制剂的敏感性是不同的 IC/ Cs2的比值作为选择性活性的标准,研 化合物14塞来昔布美洛昔康二氯酚酸 发高选择性的COX2强效抑制剂 COX2(ICso/umol L 0.5 这些化合物都未显示比化合物1更优胜的体外 COx’( Csdumol-L-)19 活性或选择性,而且灌胃给药的生物利用度也较差, 例如噻二唑化合物的体内大剂量用药,未见消化道 化合物14定名为罗非昔布( rofecoxib),进入临 溃疡的发生 Gauthier JY, Lebalnk Y, Black wc,eta.床研究。志愿者口服1g,为治疗剂量的40倍,用半 Biological evaluation of 2, 3-diarylthiophenes as selec- 体外方法测定的全血中血栓烷的生成量,表明没有 tive COX2 inhibitors. Part Il: replacing the heterocycle Bioorg Med Chem Lett,196:87-92)。进而变换结显著变化,说明对Coxl没有抑制作用。其实,恰恰 构得到了如下的构效关系:①甲磺酰基被氨磺酰基因为对COX1没有活性,过分地抑制COX2,导致罗 取代,可提高生物利用度,但也提高了对COX1的抑非昔布后来引发的心血管事件。 制作用,从而降低了对COX2的选择性作用(与塞来 动物体内实验表明,化合物14连续14天灌胃 昔布的构效关系相同)②连接基五元环上有大基团300mgkg,未见消化道损伤作用,这也与体外对 的取代也会增高CoX1的抑制活性;③大基团的取COX1低抑制作用相一致。大鼠灌胃1mgkg显示 代降低生物利用度 抗炎作用(ED0),预示化合物14的治疗窗>300。 82五元内酯环为母核化合物系列:罗非昔布的研( hich e, Dallob a, Van Hecken A, et al. Arthritis 制基于上述的构效关系,设计了通式为13的化合 Rheumatism198399 SUPPL), Prasit p, Wang Z, 物,用全血来源的或CHO全细胞来源的COX2和 Brideau C, et al. The discovery of rofecoxib, [MK 966 Vioxx, 4-(4-methylsulfonylphenyl)-3-pheny l-2(5H) COX酶评价体外活性和选择性,R为苯、吡啶或不 furanone], an orally active cyclooxygenase-2- inhibitor 同位置取代的氟代苯。结果表明,化合物14的体内 bioorg med Chem Lett,199g,9:1773-1778; Leblanc 外活性与选择性最佳( CsocoxI/ CsoCox2的比值和大Y,RoyP, Boyce S,etal. SAR in the alkoxy lactone 鼠灌胃的抗炎作用与消化道溃疡的发生)。表2列出 series: the discovery of DFP, a potent and orally active 了化合物14与塞来昔布、美洛昔康和二氯酚酸等对COX-2 inhibitor. Bioorg med Chem Lett,1999, 全血来源的COX2和COX1的抑制活性(Co),而化9:2207-2212)。罗非昔布经过三期临床研究,于199 合物14是选择性最强的抑制剂 年5月经FDA批准上市。人口服生物利用度93%,血 图3改变杂环以优化COX2选择性抑制剂

· 1014 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (6): 1010 −1016 RG, Stevens AM, Gierse JK, et al. Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti￾inflammatory agents, Nature, 1996, 384: 644 −648)。 8 罗非昔布的命运 8.1 追求高活性和高选择性抑制剂 默克公司以化 合物 1 为模板, 固定甲磺酰苯基和 4-氟代苯片段, 变 换中间的五元环连接基, 如图 3 所示的杂环母核。用 重组人 COX2 和 COX1 酶评价化合物的体外活性, 以 IC50COX1/IC50COX2 的比值作为选择性活性的标准, 研 发高选择性的 COX2 强效抑制剂。 这些化合物都未显示比化合物 1 更优胜的体外 活性或选择性, 而且灌胃给药的生物利用度也较差, 例如噻二唑化合物的体内大剂量用药, 未见消化道 溃疡的发生 (Gauthier JY, Lebalnk Y, Black WC, et al. Biological evaluation of 2,3-diarylthiophenes as selec￾tive COX2 inhibitors. Part II: replacing the heterocycle. Bioorg Med Chem Lett, 1996, 6: 87−92)。进而变换结 构得到了如下的构效关系: ① 甲磺酰基被氨磺酰基 取代, 可提高生物利用度, 但也提高了对 COX1 的抑 制作用, 从而降低了对 COX2 的选择性作用 (与塞来 昔布的构效关系相同); ② 连接基五元环上有大基团 的取代也会增高 COX1 的抑制活性; ③ 大基团的取 代降低生物利用度。 8.2 五元内酯环为母核化合物系列: 罗非昔布的研 制 基于上述的构效关系, 设计了通式为 13 的化合 物, 用全血来源的或 CHO 全细胞来源的 COX2 和 COX1 酶评价体外活性和选择性, R 为苯、吡啶或不 同位置取代的氟代苯。结果表明, 化合物 14 的体内 外活性与选择性最佳 (IC50COX1/IC50COX2 的比值和大 鼠灌胃的抗炎作用与消化道溃疡的发生)。表 2 列出 了化合物 14 与塞来昔布、美洛昔康和二氯酚酸等对 全血来源的 COX2 和 COX1 的抑制活性 (IC50), 而化 合物 14 是选择性最强的抑制剂。 表 2 化合物 14 与塞来昔布、美洛昔康和二氯酚酸对 COX2 和 COX1 的抑制活性。*全血来源的 COX 酶。不同来源的酶对 抑制剂的敏感性是不同的 化合物 14 塞来昔布 美洛昔康 二氯酚酸 COX2* (IC50/μmol·L −1 ) 0.5 1.0 0.7 0.05 COX1* (IC50/μmol·L −1 ) 19 6.3 1.4 0.15 比值 38 6.3 2 3 化合物 14 定名为罗非昔布 (rofecoxib), 进入临 床研究。志愿者口服 1 g, 为治疗剂量的 40 倍, 用半 体外方法测定的全血中血栓烷的生成量, 表明没有 显著变化, 说明对 COX1 没有抑制作用。其实, 恰恰 因为对 COX1 没有活性, 过分地抑制 COX2, 导致罗 非昔布后来引发的心血管事件。 动物体内实验表明, 化合物 14 连续 14 天灌胃 300 mg·kg−1 , 未见消化道损伤作用, 这也与体外对 COX1 低抑制作用相一致。大鼠灌胃 1 mg·kg−1 显示 抗炎作用 (ED50), 预示化合物 14 的治疗窗 > 300。 (Ehrich E, Dallob A, Van Hecken A, et al. Arthritis & Rheumatism 1996, 39 (9 SUPPL).); Prasit P, Wang Z, Brideau C, et al. The discovery of rofecoxib, [MK 966, Vioxx, 4-(4'-methylsulfonylphenyl)-3-phenyl-2(5 H)- furanone], an orally active cyclooxygenase-2-inhibitor. Bioorg Med Chem Lett, 1999, 9: 1773−1778; Leblanc Y, Roy P, Boyce S, et al. SAR in the alkoxy lactone series: the discovery of DFP, a potent and orally active COX-2 inhibitor. Bioorg Med Chem Lett, 1999, 9: 2207−2212)。罗非昔布经过三期临床研究, 于 1999 年 5 月经 FDA 批准上市。人口服生物利用度 93%, 血 图 3 改变杂环以优化 COX2 选择性抑制剂