第四章单克隆杭保 使整个工作由于污染而功亏一篑。因此，避免污染是组织培养实验工作中不可轻视的一环， 常见的微生物污染丰要来自病臺、细菌、直菌及支原体。污染源主要来自于原代培养、血洁 实验室工作人员、污染的培养物及实验环境。避免污染的最好方法莫过于建立一个严格的实 验室管理制度和良好的无南操作技术，这包括对任何引入新细胞系进行仔细的检测，对所有 的组织培养试剂在使用前都应作细菌及真菌检查。 细菌的污染可以用抗生素来控制，然而常规在培养体系中加人抗生素会导致耐药株的选 择性繁殖，从而有可能使实验环境处于耐药株的污染中。尽管如此，培养体系中仍然常规地 加入青霉素100Uml和链莓素100μgml。当有青、链霉素耐药株出现时，则可加入庆大霉 素(entamycin)0.2mg/ml或卡那霉素(kanamycin)50Oug/ml,但这种处理的效果并不好。 真菌的污染是难以防范的。这主要是由于温热湿润的条件是霉菌生长的良好环境。定期 清洁有助于控制真南的污染。虽然在培养中加入两性霉素B(fungizone,ampholericin B, 5~10ugml)或制霉菌素(mycostatin,100μgml)可以控制某些真菌的生长，然而一旦发 生真菌污染，往往也无能为力。这是因为真菌生长迅速，这两种抗生素的用量稍大也会影响 杂交瘤细胞的生长，所以当发现有真菌污染时最好的方法是将其销毁，也可以在有真菌的孔 中加入lmoL氢氧化钠或2molL硫酸铜溶液，或者隔离重要的培养皿，并制备出复制品， 尤其对具有重要意义的杂交瘤细胞更应采取备份培养的方法。 细菌或真菌的污染可用肉眼或显微镜看到，而另一种更隐蔽的污染是支原体污染。支原 体是一种比病毒颗粒大、比细菌小的微生物，大小为0.22μm左右，约有1%可以通过0.22μm 滤菌器。常见的支原体主要来自人体及血清。支原体污染细胞后，培养基中除酚红指示剂显 示偏酸外，并不发生浑浊，细胞病理变化轻微，所以很难发现。用作融合亲代细胞的骨髓瘤 细胞在体外长期培养传代时，很容易受到这种难以察觉的污染，导致细胞增殖减缓。融合时， 杂交瘤的产生会受到明显影响，在融合后1周左右即可发现许多融合细胞突然崩解。由于支 原体污染是在不易观察的情况下发生的，其预防较为困难。良好的实验环境、良好的无菌操 作技术及优质的胎牛血清和试剂等仍然是很重要的环节。另外在引入新的细胞系时，应检测 细胞是否污染支原体，如果无支原体污染，细胞生长良好，应先培养冻存一批，以供备用。 用作融合的骨髓瘤细胞不宜长期在体外培养，一旦发现细胞生长变慢，支原体检查阳性，应 立即废弃。支原体不尉热，也可以在41C恒温培养讨夜，但这种方法需要了解细胞对热处 理的耐受程度。如果具有重要价值的杂交瘤细胞被支原体污染，不仅影响抗体的分泌特性， 而且也影响其应用。这时可采取的补救办法是将杂交瘤细胞或骨篇痴细胞接种于小鼠腹腕 内，利用机体的免疫系统来清除细胞的支原体。近年来采用BM-cycline等试剂处理被污染 的细胞获得相当良好的结果，而且操作方法也简便。 (二)小眼免疫 1.抗原 任何能引起免疫反应的物质都可以作为抗原。抗原在体内引起的兔疫反应与机体对抗原 的识别有关。抗原的初次免疫能使机体产生多价的低亲和力的gM。随着相同抗原的反复免 疫，机体产生抗体的反应加速，主要产生二价的gG。抗体的亲和力和血清中的滴度也随着 免疫次数的增多而增强。在杂交瘤的制备过程中，免疫的目的是使B细胞在抗原的刺激下 -54
第四章 单克隆抗体 - 54 - 使整个工作由于污染而功亏一篑。因此，避免污染是组织培养实验工作中不可轻视的一环， 常见的微生物污染主要来自病毒、细菌、真菌及支原体。污染源主要来自于原代培养、血清、 实验室工作人员、污染的培养物及实验环境。避免污染的最好方法莫过于建立一个严格的实 验室管理制度和良好的无菌操作技术，这包括对任何引入新细胞系进行仔细的检测，对所有 的组织培养试剂在使用前都应作细菌及真菌检查。 细菌的污染可以用抗生素来控制，然而常规在培养体系中加人抗生素会导致耐药株的选 择性繁殖，从而有可能使实验环境处于耐药株的污染中。尽管如此，培养体系中仍然常规地 加入青霉素 100U/ml 和链霉素 100μg/ml。当有青、链霉素耐药株出现时，则可加入庆大霉 素（gentamycin）0.2mg/ml 或卡那霉素（kanamycin）500μg/ml，但这种处理的效果并不好。 真菌的污染是难以防范的。这主要是由于温热湿润的条件是霉菌生长的良好环境。定期 清洁有助于控制真菌的污染。虽然在培养中加入两性霉素 B（fungizone，ampholericin B， 5~10μg/ml）或制霉菌素（mycostatin，100μg/ml ）可以控制某些真菌的生长，然而一旦发 生真菌污染，往往也无能为力。这是因为真菌生长迅速，这两种抗生素的用量稍大也会影响 杂交瘤细胞的生长，所以当发现有真菌污染时最好的方法是将其销毁，也可以在有真菌的孔 中加入 lmol/L 氢氧化钠或 2mol/L 硫酸铜溶液，或者隔离重要的培养皿，并制备出复制品， 尤其对具有重要意义的杂交瘤细胞更应采取备份培养的方法。 细菌或真菌的污染可用肉眼或显微镜看到，而另一种更隐蔽的污染是支原体污染。支原 体是一种比病毒颗粒大、比细菌小的微生物，大小为 0.22μm 左右，约有 1％可以通过 0.22μm 滤菌器。常见的支原体主要来自人体及血清。支原体污染细胞后，培养基中除酚红指示剂显 示偏酸外，并不发生浑浊，细胞病理变化轻微，所以很难发现。用作融合亲代细胞的骨髓瘤 细胞在体外长期培养传代时，很容易受到这种难以察觉的污染，导致细胞增殖减缓。融合时， 杂交瘤的产生会受到明显影响，在融合后 1 周左右即可发现许多融合细胞突然崩解。由于支 原体污染是在不易观察的情况下发生的，其预防较为困难。良好的实验环境、良好的无菌操 作技术及优质的胎牛血清和试剂等仍然是很重要的环节。另外在引入新的细胞系时，应检测 细胞是否污染支原体，如果无支原体污染，细胞生长良好，应先培养冻存一批，以供备用。 用作融合的骨髓瘤细胞不宜长期在体外培养，一旦发现细胞生长变慢，支原体检查阳性，应 立即废弃。支原体不耐热，也可以在 41℃恒温培养过夜，但这种方法需要了解细胞对热处 理的耐受程度。如果具有重要价值的杂交瘤细胞被支原体污染，不仅影响抗体的分泌特性， 而且也影响其应用。这时可采取的补救办法是将杂交瘤细胞或骨髓瘤细胞接种于小鼠腹腔 内，利用机体的免疫系统来清除细胞的支原体。近年来采用 BM-cycline 等试剂处理被污染 的细胞获得相当良好的结果，而且操作方法也简便。 (二) 小鼠免疫 1． 抗原 任何能引起免疫反应的物质都可以作为抗原。抗原在体内引起的免疫反应与机体对抗原 的识别有关。抗原的初次免疫能使机体产生多价的低亲和力的 IgM。随着相同抗原的反复免 疫，机体产生抗体的反应加速，主要产生二价的 IgG。抗体的亲和力和血清中的滴度也随着 免疫次数的增多而增强。在杂交瘤的制备过程中，免疫的目的是使 B 细胞在抗原的刺激下
第四章单克隆杭体 分化、增殖，有利于细胞融合形成杂交瘤，尤其是增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的几率。 因此，免疫的效果是关系到能否获得特异性单抗的重要一环。 当需要免疫的抗原和动物确定之后，就应认真设计免疫方案，对抗原的质量、免疫途径、 次数、间隔及是否应用佐剂都应有一个总体考虑，甚至包括动物对抗原的免疫应答的检测都 应事先有所安排。 抗原的免疫包括体内免疫和体外免疫，本文主要叙述体内免疫的一些方法。为便于实验 操作，在动物的免疫过程中，我们常将抗原分为可溶性抗原和颗粒性抗原。前者如蛋白质、 碳水化合物或核酸等，后者如病毒、细菌和细胞等。一般颗粒性抗原都具有较强的免疫原性， 可以不加佐剂，而可溶性蛋白抗原在免疫时应添加佐剂。 用1g的可溶性蛋白抗原免疫小鼠，即可产生强烈的免疫反应。但一般在初次免疫中都 用10一20ug的抗原量。当有足够的抗原时，可以一次注射50ug。很少有一次超过200ug, 即使抗原不够纯时，总的注射量一般也不超过500ug。没有免疫原性的半抗原分子可与钥孔 成蓝蛋白或白蛋白等大分子蛋白偶合在一起，赋予其免疫原性。 颗粒性抗原由于能很快地被吞噬，所以是非常好的免疫原。利用可溶性抗原自身的多聚 效应可将其固相化在琼脂上而成为颗粒性抗原。由于重组DNA技术的进展，易于制备出重 组蛋白抗原。这些重组蛋白有极好的抗原性，在单抗的制备中十分有用。而且这些蛋白可以 纯化，以可溶性或固相化的形式进行免疫。 另一种免疫原是根据编码序列在体外合成多肽。当合成肽与牛血清蛋白或钥孔戚蓝蛋白 等载体蛋白交联后，即可成为强兔疫原。用多肽抗原免疫制备抗体的主要问题是所获抗体能 否与天然蛋白相结合。 活细胞也可以作为免疫原以制备针对细胞表面或内部抗原的单抗。在制备抗肿瘤细胞的 单克隆抗体时应尽可能保证肿瘤组织细胞的纯度。 核酸的抗原性很弱，通常是将其作为半抗原交联到载体蛋自上。分子量超过50000、大 而复杂的碳水化合物会引起中等程度的免疫反应，但重复免疫并不总能产生继发反应，大剂 量又会引起耐受，所以注射剂量应加以严格的控制。 2.动物选择 在开始设计免疫方案之前要选择合适的动物品系。应考虑动物的耐受性、可利用的抗原 数量及所制备抗体的特性（包括是否容易纯化）。一般选择6周龄的雌性BLB小鼠免疫。 因融合所用骨髓瘤细胞多来自该品系的小鼠，所获杂交瘤细胞可接种于BALB/c小鼠，制备 含抗体的腹水。当受检的免疫动物的血清中出现所需要的抗体时才开始做融合，如果抗血清 的效价较低，会增加获得理想单克隆抗体杂交瘤细胞的难度。 3.兔疫途径 兔疫的效果除决定于抗原的性质和宿主反应外，亦与兔疫途径有关。不同的抗原可经不 同的途径免疫。常用的免疫途径为皮下、腹腔、淋巴结及静脉，亦可经皮内或肌肉内注射。 为了增加抗原的免疫原性，可以将抗原交联到琼脂珠或聚丙烯酰胺等一些载体上，以利 吞噬细胞的吞噬。将蛋白抗原固相化到硝酸纤维膜上也可增加其免疫原性。也可将含有抗原 的硝酸纤维膜直接移植到小鼠皮下，或将含有抗原的硝酸纤维膜研碎之后悬浮于PBS中， 或用二甲基亚砜或丙酮溶解硝酸纤维膜之后，再悬浮于PBS或加入完全福氏佐剂乳化后进 -55
第四章 单克隆抗体 - 55 - 分化、增殖，有利于细胞融合形成杂交瘤，尤其是增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的几率。 因此，免疫的效果是关系到能否获得特异性单抗的重要一环。 当需要免疫的抗原和动物确定之后，就应认真设计免疫方案，对抗原的质量、免疫途径、 次数、间隔及是否应用佐剂都应有一个总体考虑，甚至包括动物对抗原的免疫应答的检测都 应事先有所安排。 抗原的免疫包括体内免疫和体外免疫，本文主要叙述体内免疫的一些方法。为便于实验 操作，在动物的免疫过程中，我们常将抗原分为可溶性抗原和颗粒性抗原。前者如蛋白质、 碳水化合物或核酸等，后者如病毒、细菌和细胞等。一般颗粒性抗原都具有较强的免疫原性， 可以不加佐剂，而可溶性蛋白抗原在免疫时应添加佐剂。 用 l μg 的可溶性蛋白抗原免疫小鼠，即可产生强烈的免疫反应。但一般在初次免疫中都 用 10～20μg 的抗原量。当有足够的抗原时，可以一次注射 50μg。很少有一次超过 200μg， 即使抗原不够纯时，总的注射量一般也不超过 500μg。没有免疫原性的半抗原分子可与钥孔 戚蓝蛋白或白蛋白等大分子蛋白偶合在一起，赋予其免疫原性。 颗粒性抗原由于能很快地被吞噬，所以是非常好的免疫原。利用可溶性抗原自身的多聚 效应可将其固相化在琼脂上而成为颗粒性抗原。由于重组 DNA 技术的进展，易于制备出重 组蛋白抗原。这些重组蛋白有极好的抗原性，在单抗的制备中十分有用。而且这些蛋白可以 纯化，以可溶性或固相化的形式进行免疫。 另一种免疫原是根据编码序列在体外合成多肽。当合成肽与牛血清蛋白或钥孔戚蓝蛋白 等载体蛋白交联后，即可成为强免疫原。用多肽抗原免疫制备抗体的主要问题是所获抗体能 否与天然蛋白相结合。 活细胞也可以作为免疫原以制备针对细胞表面或内部抗原的单抗。在制备抗肿瘤细胞的 单克隆抗体时应尽可能保证肿瘤组织细胞的纯度。 核酸的抗原性很弱，通常是将其作为半抗原交联到载体蛋白上。分子量超过 50000、大 而复杂的碳水化合物会引起中等程度的免疫反应，但重复免疫并不总能产生继发反应，大剂 量又会引起耐受，所以注射剂量应加以严格的控制。 2． 动物选择 在开始设计免疫方案之前要选择合适的动物品系。应考虑动物的耐受性、可利用的抗原 数量及所制备抗体的特性（包括是否容易纯化）。一般选择 6 周龄的雌性 BALB/c 小鼠免疫， 因融合所用骨髓瘤细胞多来自该品系的小鼠，所获杂交瘤细胞可接种于 BALB/c 小鼠，制备 含抗体的腹水。当受检的免疫动物的血清中出现所需要的抗体时才开始做融合，如果抗血清 的效价较低，会增加获得理想单克隆抗体杂交瘤细胞的难度。 3． 免疫途径 免疫的效果除决定于抗原的性质和宿主反应外，亦与免疫途径有关。不同的抗原可经不 同的途径免疫。常用的免疫途径为皮下、腹腔、淋巴结及静脉，亦可经皮内或肌肉内注射。 为了增加抗原的免疫原性，可以将抗原交联到琼脂珠或聚丙烯酰胺等一些载体上，以利 吞噬细胞的吞噬。将蛋白抗原固相化到硝酸纤维膜上也可增加其免疫原性。也可将含有抗原 的硝酸纤维膜直接移植到小鼠皮下，或将含有抗原的硝酸纤维膜研碎之后悬浮于 PBS 中， 或用二甲基亚砜或丙酮溶解硝酸纤维膜之后，再悬浮于 PBS 或加入完全福氏佐剂乳化后进
第四章单克隆杭保 行免疫。 皮下局部注射可以将可溶性或不溶性抗原注射到淋巴结引流区。一般皮下注射的总量不 超过1OO如l,而且皮下多点注射有利于增加免疫效果。皮下注射可以应用完全福氏佐剂，但 由于其可能的毒性，在制备及注射中要十分谨慎。 融合前一般都需要进行抗原冲击，静脉注射是最常用的途径。抗原经静脉进入血液循环 之后，讯谏被脾时、肝脏成肺中的后邀细南所吞磁、加工，从而产生强列的反应。但反应的 时间较短促。静脉注射一般不作为初次免疫的途径，尤其是不应作为大颗粒性抗原的免疫途 径，因为很可能引起血栓，损伤主要脏器，引起过敏反应，也容易诱发免疫耐受。在注射的 溶液中不应含有高浓度的变性剂或叠复钠一类有毒的防腐剂。 在进行次级免疫或抗原冲击时，理论上最好的方法是将这类抗原直接注射到淋巴样器官 中，如牌脏或足垫中。当抗原量少至纳克(g)时，用脾内免疫仍能获得良好的免疫效果。 微量抗原的脾内免疫较其他注入途径有更多的技术要求。打开麻醉的小鼠腹腔，用最小号的 注射针头经脾脏尾端刺入脾脏，将抗原悬液慢慢的注入脾内（约20如），轻轻压迫针孔待不 再渗出血液或液体时，即可缝合关闭腹腔。如果埋入吸附有抗原的硝酸纤维膜，则将约 2mm×3mm的三角形膜片经小切口插入到脾脏远端，将它埋植到脾脏组织中。脾脏可被重复 进行免疫。但使用微量抗原脾内免疫通常不会产生明显的血清抗体，所以即使没有明显的阳 性血清反应时，也可进行细胞融合。 4.截体 除了白蛋白、钥孔或蓝蛋白等大分子外，任何一种小的、情性的、无毒性、能固定抗原 并可使抗原缓慢释放的物质都可作为载体。抗原与载体的结合可以是特异性的或非特异性 的。载体的选择取决于抗原的种类，在交联或其它操作过程中应避免抗原构型改变而失活。 常用的载体可分为珠体和膜两类，珠体能与配基如蛋白A或G共价交联，而配基与免 疫原可有特异的亲和力。连接暴露的氨基、羟基、羟基、或巯基的衍生物珠体可制成珠体 配基抗原复合物。 脂质体是由磷脂化合物构成的多层囊泡，各种免疫原可包裹嵌在脂质体的多层膜间。由 于它在体内能被巨噬细胞迅速吞噬，在细胞内被缓慢地逐步释放，因而具有较强的增强免疫 原性的作用。硝酸纤维膜、尼龙膜和阳离子尼龙膜也可以分别与亲水性蛋白质、疏水物质、 以及寡核苷酸、DNA和RNA结合，可以直接将抗原滴于膜上，亦可在电泳后印迹转移到膜 上，取抗原区带用于免疫。 二、细胞融合 细胞融合是杂交瘤产生的中心环节，这一步关系到全部工作的成败。操作的全部过程沙 须在严格无菌的条件下进行。细胞融合要准备两种细胞，骨髓瘤细胞和脾细胞。 (一)主要试剂 1.培养基 完全RPM-1640(含20%FCS)或完全DMEM培养基（含20%FCS,20 nmol/LHEPES -56-
第四章 单克隆抗体 - 56 - 行免疫。 皮下局部注射可以将可溶性或不溶性抗原注射到淋巴结引流区。一般皮下注射的总量不 超过 100μl，而且皮下多点注射有利于增加免疫效果。皮下注射可以应用完全福氏佐剂，但 由于其可能的毒性，在制备及注射中要十分谨慎。 融合前一般都需要进行抗原冲击，静脉注射是最常用的途径。抗原经静脉进入血液循环 之后，迅速被脾脏、肝脏或肺中的巨噬细胞所吞噬、加工，从而产生强烈的反应。但反应的 时间较短促。静脉注射一般不作为初次免疫的途径，尤其是不应作为大颗粒性抗原的免疫途 径，因为很可能引起血栓，损伤主要脏器，引起过敏反应，也容易诱发免疫耐受。在注射的 溶液中不应含有高浓度的变性剂或叠氮钠一类有毒的防腐剂。 在进行次级免疫或抗原冲击时，理论上最好的方法是将这类抗原直接注射到淋巴样器官 中，如脾脏或足垫中。当抗原量少至纳克（ng）时，用脾内免疫仍能获得良好的免疫效果。 微量抗原的脾内免疫较其他注入途径有更多的技术要求。打开麻醉的小鼠腹腔，用最小号的 注射针头经脾脏尾端刺入脾脏，将抗原悬液慢慢的注入脾内（约 20μl），轻轻压迫针孔待不 再渗出血液或液体时，即可缝合关闭腹腔。如果埋入吸附有抗原的硝酸纤维膜，则将约 2mm×3mm 的三角形膜片经小切口插入到脾脏远端，将它埋植到脾脏组织中。脾脏可被重复 进行免疫。但使用微量抗原脾内免疫通常不会产生明显的血清抗体，所以即使没有明显的阳 性血清反应时，也可进行细胞融合。 4． 载体 除了白蛋白、钥孔戚蓝蛋白等大分子外，任何一种小的、惰性的、无毒性、能固定抗原 并可使抗原缓慢释放的物质都可作为载体。抗原与载体的结合可以是特异性的或非特异性 的。载体的选择取决于抗原的种类，在交联或其它操作过程中应避免抗原构型改变而失活。 常用的载体可分为珠体和膜两类，珠体能与配基如蛋白 A 或 G 共价交联，而配基与免 疫原可有特异的亲和力。连接暴露的氨基、羟基、羟基、或巯基的衍生物珠体可制成珠体- 配基-抗原复合物。 脂质体是由磷脂化合物构成的多层囊泡，各种免疫原可包裹嵌在脂质体的多层膜间。由 于它在体内能被巨噬细胞迅速吞噬，在细胞内被缓慢地逐步释放，因而具有较强的增强免疫 原性的作用。硝酸纤维膜、尼龙膜和阳离子尼龙膜也可以分别与亲水性蛋白质、疏水物质、 以及寡核苷酸、DNA 和 RNA 结合，可以直接将抗原滴于膜上，亦可在电泳后印迹转移到膜 上，取抗原区带用于免疫。 二、细胞融合 细胞融合是杂交瘤产生的中心环节，这一步关系到全部工作的成败。操作的全部过程必 须在严格无菌的条件下进行。细胞融合要准备两种细胞，骨髓瘤细胞和脾细胞。 (一) 主要试剂 1. 培养基 完全 RPMI-1640（含 20％FCS）或完全 DMEM 培养基（含 20％FCS，20mmol/L HEPES
第四章单克隆杭体 及ImmoVL丙酮酸钠)，不完全RPM-I640或DMEM培养基（不含血清） 2.HAT培养液 ()HAT100倍贮存液称取136.1mg的次黄嘌吟(H),1.9mg的氨基碟吟(A)和38.8mg 的胸腺嘧啶核苷(T),略偏碱，以促进溶解。贮存液过滤除菌，20℃冻存备用。现在实验 室一般都用商品化的现成贮存液 (2)HAT应用液每1O0ml完全培养基加入1ml上述HAT贮存液。 3.HT培养液 ()HT100倍贮存液称取136.mg次黄嘌岭(H)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(T)溶于 100ml双蒸水，过滤除菌，-20C冻存备用。现在实验室一般都用商品化的现成贮存液。 (2)HT应用液每100ml完全培养基中加入Iml上述HT贮存液。 4.50%PEG溶液 在玻璃瓶中高压10g分子量为4000的PEG(15si15分钟)，使之溶化为液体，冷却， 在其凝固之前（约55℃）加入10ml不完全DMEM培养液（可以供20次融合使用，可以在 室温存几个月之久)。 注：不能用含有蛋白的培养基配制PEG溶液。浓度低于30%的PEG融合成功率低：高 于50%的PEG对细胞毒性大。 (仁)骨髓瘤细胞的准备 1,骨髓瘤细胞的选择 目前可供应用的骨萄南系来自小鼠、大鼠和人等。由于对骨髓瘤的诱发过程高度敏感的 只有BALB和N2B品系小鼠，所以来自两种品系的骨髓瘤细胞较多，人类尚无广泛成熟 应用的细胞系。下表为几种可选用的鼠骨髓指细胞系（表41）。 表41几种常用的鼠骨随瘤细胞系 细胞系 物种（品系） 特性 P3-X63-Ag8 小鼠BALB/c 分泌gG,现在很少应用 P3-NS1/1-Ag4-1 小鼠BALB/e 合成轻链，HAT选择 P3-X63-Ag8.653 小鼠BALB/C 不合成Ig,较广泛应用，HAT选择 SP2/0-Ag14 小鼠BALB/c 不合成Ig,广泛应用，HAT选择 小鼠BALB/C 不合成g,HAT选择 S194/5 XXO BU 1 小鼠BALB/ 不合成Ig,HAT选择 210-CRY3-Agl 大鼠Lou/c 分泌K轻链，HAT选择 YB2/3Ag20 大鼠Louc 不合成Ig,HAT选择 IK983F 大鼠Lou/C 不合成Ig,HAT选择 由于在细胞融合过程中，骨髓瘤细胞与脾细胞的轻重链可能会随机地相互结合。为了避 -57
第四章 单克隆抗体 - 57 - 及 1mmol/L 丙酮酸钠），不完全 RPMI-1640 或 DMEM 培养基（不含血清）。 2．HAT 培养液 (1) HAT 100 倍贮存液 称取 136.1mg 的次黄嘌呤（H），1.9mg 的氨基碟呤（A）和 38.8mg 的胸腺嘧啶核苷（T），略偏碱，以促进溶解。贮存液过滤除菌，-20℃冻存备用。现在实验 室一般都用商品化的现成贮存液。 (2) HAT 应用液 每 100ml 完全培养基加入 1 ml 上述 HAT 贮存液。 3．HT 培养液 (1) HT 100 倍贮存液 称取 136.mg 次黄嘌呤（H）和 38.8mg 胸腺嘧啶核苷（T）溶于 100ml 双蒸水，过滤除菌，-20℃冻存备用。现在实验室一般都用商品化的现成贮存液。 (2) HT 应用液 每 100ml 完全培养基中加入 l ml 上述 HT 贮存液。 4．50%PEG 溶液 在玻璃瓶中高压 10g 分子量为 4000 的 PEG（15psi/15 分钟），使之溶化为液体，冷却， 在其凝固之前（约 55℃）加入 10ml 不完全 DMEM 培养液(可以供 20 次融合使用，可以在 室温存几个月之久)。 注：不能用含有蛋白的培养基配制 PEG 溶液。浓度低于 30％的 PEG 融合成功率低；高 于 50%的 PEG 对细胞毒性大。 (二) 骨髓瘤细胞的准备 1． 骨髓瘤细胞的选择 目前可供应用的骨髓瘤系来自小鼠、大鼠和人等。由于对骨髓瘤的诱发过程高度敏感的 只有 BALB/c 和 N2B 品系小鼠，所以来自两种品系的骨髓瘤细胞较多，人类尚无广泛成熟 应用的细胞系。下表为几种可选用的鼠骨髓瘤细胞系（表 4-1）。 表 4-1 几种常用的鼠骨髓瘤细胞系 细 胞 系 物种（品系） 特 性 P3-X63-Ag8 小鼠 BALB/c 分泌 IgG，现在很少应用 P3-NS1/1-Ag4-1 小鼠 BALB/c 合成κ轻链，HAT 选择 P3-X63-Ag8.653 小鼠 BALB/c 不合成 Ig，较广泛应用，HAT 选择 SP2/0-Ag14 小鼠 BALB/c 不合成 Ig，广泛应用，HAT 选择 FO 小鼠 BALB/c 不合成 Ig，HAT 选择 S194/5 XXO.BU.1 小鼠 BALB/c 不合成 Ig，HAT 选择 210-CRY3-Ag1 大鼠 Lou/c 分泌κ轻链，HAT 选择 YB2/3Ag20 大鼠 Lou/c 不合成 Ig，HAT 选择 IK983F 大鼠 Lou/c 不合成 Ig，HAT 选择 由于在细胞融合过程中，骨髓瘤细胞与脾细胞的轻重链可能会随机地相互结合。为了避