输卵管切开 (A) Fatpad 1)通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。 Ovary Poke hole in mesometrium Oviduct close to oviduct with tip of closed forceps or scissors 2)将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手 术部位。 3)用眼科镊捏紧正中线皮肤，用外科剪剪出一个横切 Pull back Mesometrium or membrane 口，钝性分离皮肤与肌肉，充分暴露背侧腰部肌肉。 Uterus carrying prominent blood vessel 4)卵巢位于脊柱两侧隐约可见的白色脂肪团的下方， 用眼科镊拎起脂肪团上腹膜，眼科剪在此处开一小口， 用镊子夹住脂肪垫，轻轻地将子宫、输卵管、卵巢拉出 (B) Reposition 体腔。 forceps Cut 5)用眼科镊将输卵管、卵巢和脂肪团拉伸，用眼科剪 Cut between oviduct and ovary with fine scissors 在输卵管和卵巢之间剪开，重新定位眼科镊的位置，然 Pull back iduct 后在靠近输卵管的子宫部剪开，将断离的输卵管放入预 先准备好的小玻璃皿中的M2液滴中。对另一侧输卵管 重复上面操作
输卵管切开 1） 通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。 2） 将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手 术部位。 3） 用眼科镊捏紧正中线皮肤，用外科剪剪出一个横切 口，钝性分离皮肤与肌肉，充分暴露背侧腰部肌肉。 4） 卵巢位于脊柱两侧隐约可见的白色脂肪团的下方， 用眼科镊拎起脂肪团上腹膜，眼科剪在此处开一小口， 用镊子夹住脂肪垫，轻轻地将子宫、输卵管、卵巢拉出 体腔。 5） 用眼科镊将输卵管、卵巢和脂肪团拉伸，用眼科剪 在输卵管和卵巢之间剪开，重新定位眼科镊的位置，然 后在靠近输卵管的子宫部剪开，将断离的输卵管放入预 先准备好的小玻璃皿中的 M2 液滴中。对另一侧输卵管 重复上面操作
Transfer capillary 体输卵管内受精卵的收集与处理 Capillary holder Mouth pie 1)用眼科摄撕开输卵管膨大的壶腹部，即看到包绕受精卵 的丘细胞团。游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤 Sterile filter 压输卵管将受精卵推出裂口。 ubing 2)全部卵群取出后，将其转移到一个约200u1的液滴中 加入10-15ul的500U/ml透明质酸酶(hyaluronidase)消化 颗粒细胞，约30秒-1分钟，必要时用毛细管吹打卵群数次。 b 如颗粒细胞全部脱落，则开始清洗步骤；如仍有部分未脱落 则再等待数十秒直到全部脱落。 3)洗涤：用玻璃细管（直径约120um-250um,即大于一个 受精卵的直径而小于二个受精卵的直径)把受精卵在新的M2 液滴中转移五次，洗去颗粒细胞、残渣及透明质酸酶，将洗 M2 medium 好的受精卵转移到覆盖有矿物油（可防止污染同时防止培养 基水分蒸发影响pH)的M16液滴（在5%CO2、37℃培养箱 中平衡过夜，保证正确pH值)中，再放入5%C02、37℃ 培养箱中备用
体输卵管内受精卵的收集与处理 1） 用眼科镊撕开输卵管膨大的壶腹部，即看到包绕受精卵 的丘细胞团。游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤 压输卵管将受精卵推出裂口。 2） 全部卵群取出后，将其转移到一个约 200ul 的液滴中， 加入 10-15ul 的 500U/ml 透明质酸酶（hyaluronidase）消化 颗粒细胞，约30秒-1分钟，必要时用毛细管吹打卵群数次。 如颗粒细胞全部脱落，则开始清洗步骤；如仍有部分未脱落 则再等待数十秒直到全部脱落。 3） 洗涤：用玻璃细管（直径约120um-250um，即大于一个 受精卵的直径而小于二个受精卵的直径）把受精卵在新的 M2 液滴中转移五次，洗去颗粒细胞、残渣及透明质酸酶，将洗 好的受精卵转移到覆盖有矿物油（可防止污染同时防止培养 基水分蒸发影响pH）的 M16 液滴（在 5%CO2、37℃培养箱 中平衡过夜，保证正确 pH 值）中，再放入 5%CO2、37℃ 培养箱中备用
受精卵专用培养基 M2和M16培养基 化学诚份 M16 (mmol/L) NaCl 95.00 M2与M16都是化学成份明确的培养基（chemically defined medium;CDM)。CDM含胚胎需要、能维持和 KCL 4.80 胚胎生长发育，分裂繁殖的化学成分：多种盐离子、能 KH2PO4 1.20 量物质、生长因子、动物白蛋白或含蛋白等大分子的各 NaHCO3 25.00 种动物血清。 CaCL2 1.70 标准的M16在上世纪70年代初定型，现已商业化，是世 MgSO 1.20 界各地实验室仍常用于小鼠胚胎实验的一种CDM。M2是 在M16基础上添加了HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。利 Na-lactate 23.00 用HEPES可适当延长培养基和其中培养物在自然环境下 Na-pyruvate 0.33 (二氧化碳培养箱外)的使用时间。因其可较长时间维持一 Glucose 5.60 定的H平衡，便于自然环境下操作应用。M2更适于小鼠 等动物在采集卵母细胞，或胚胎在相对较长时间的体外 BSA(mg/ml) 4.00 操作等环节应用。 Osmolarity (mOsm) 290
M2 和 M16培养基 M2与M16都是化学成份明确的培养基（chemically defined medium；CDM）。CDM含胚胎需要、能维持和 胚胎生长发育，分裂繁殖的化学成分：多种盐离子、能 量物质、生长因子、动物白蛋白或含蛋白等大分子的各 种动物血清。 标准的M16在上世纪70年代初定型，现已商业化，是世 界各地实验室仍常用于小鼠胚胎实验的一种CDM。M2是 在M16基础上添加了HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。利 用HEPES可适当延长培养基和其中培养物在自然环境下 (二氧化碳培养箱外)的使用时间。因其可较长时间维持一 定的pH平衡，便于自然环境下操作应用。M2更适于小鼠 等动物在采集卵母细胞，或胚胎在相对较长时间的体外 操作等环节应用。 受精卵专用培养基